Nuestro trabajo fue posible gracias al apoyo financiero del Fondo de Dotación de McKnight para la Neurociencia (PAS), el Instituto Nacional sobre Abuso de Drogas (R01 DA019022; PAS) y un pre-doctoral NIH NRSA beca para PA (F31AA017042) del Instituto Nacional sobre Abuso del Alcohol y el Alcoholismo. El mutante GIRK2-L257W fue proporcionada por el Dr. Prafulla Aryal. Microscopio de fluorescencia y el patrocinio amablemente proporcionados por los equipos Leica.

1. Mutagénesis dirigida Utilizamos la expresión de mamíferos pcDNA3.1 plásmido que codifica para un cDNA de GIRK2 e introducir una mutación puntual utilizando Stratagene (Agilent Technologies) QuikChange XL II dirigida a un sitio kit de mutagénesis, de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Secuencia de los cebadores se pueden generar fácilmente mediante el programa de diseño de la cartilla en línea disponible en: <a href="https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15">https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&amp;SubPageType=ToolQCPD&amp;PageID=15</a> Nota: el uso estándar de Eppendorf de 1,5 ml en lugar de BD 14 ml tubos descritos en el protocolo. Sin embargo, el uso de XL10-Gold ultracompetent E. coli previamente con β-mercaptoetanol, 30s choque térmico y NZY + (o NZYM +) los medios de comunicación son fundamentales para el éxito de la mutagénesis. Si es posible, la ingeniería una mutación adicional en silencio que crea un nuevo sitio de restricción puede ser conveniente para la detección de colonias mutantes a continuación. 2. Miniprep, secuenciación de ADN y Maxiprep 2.1 Qiagen minipreparación y secuenciación. Individual colonias de bacterias se recogen y se cultivaron en caldo LB con ampicilina (AMP). Seguimos las instrucciones del fabricante para la purificación de la DNA. Un resumen simple restricción se puede utilizar confirmar la exitosa introducción de la mutación, si un sitio de restricción se ha incorporado en el paso 1. Secuenciación automática de ADN se realiza fuera del sitio, y es esencial para confirmar la presencia de la mutación en el cDNA, así como evaluar si hay alguna mutaciones no deseadas. Este paso es muy importante. Nos secuencia de la secuencia de codificación de toda la GIRK utilizando adelante promotor T7 y revertir BGH cebadores de secuenciación que flanquean el sitio de clonación múltiple del plásmido pcDNA3.1. Nota: Es importante inspeccionar cuidadosamente la secuencia electroferograma para asegurar la calidad suficiente de los datos de secuenciación. Electroferograma de alta calidad ha afilado, que no se superponen con los picos de ruido de fondo. 2.2 Qiagen maxiprep. Seguimos las instrucciones del fabricante. Nota: Este paso está incluido en nuestros experimentos para mejorar la pureza del cDNA, que nos encontramos es importante para la transfección eficiente. 3. La cultura y la transfección de células HEK293T Todos estos pasos deben realizarse en una campana de cultivo de tejido estéril. 3.1 de cultivo celular HEK293T células son convenientes porque son fáciles de la cultura (37 ° C, 5% de CO 2 incubadora humidificada), tienen el tiempo de replicación rápida, de alta eficiencia de transfección y son susceptibles de células enteras patch-clamp electrofisiología. HEK293T células expresan el antígeno T SV40 grande que asegura la replicación episomal de plásmido pcDNA3.1. HEK293T células se cultivan en bajos de glucosa en DMEM los medios suplementados con L-glutamina y el 10% de suero fetal bovino (FBS). Para las células pases, añadir 0,25% de tripsina / EDTA a las células confluentes HEK293T (90-95%), esperar hasta que las células se desprenden de la placa del tejido, y luego se detiene la actividad de la enzima por la adición de medio fresco que contiene FBS /. Placa de ~ 1 X 10 5 células / pocillo en una placa de cultivo de 12 células, junto con 1 ml de medio de cultivo libre de antibióticos por pozo. (1 X 10 5 células se ~ 350 l de suspensión celular obtenida a partir de confluencia T25 frasco resuspendió con 10 ml de medio). 3.2 Transfección Después de 8.24 horas, las células HEK se adhiere al plástico y están listos para la transfección. Transfectar células con el canal de 0,2 mg cDNA, 0,4 mg M2R receptor cDNA y 0,04 mg YFP cDNA utilizando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: se utiliza una pequeña cantidad de YFP cDNA para determinar qué células son transfectadas con éxito (células verdes probable que contenga ambos canales GIRK y los receptores M2). La concentración de cDNA utilizar tendrá que ser ajustada para cada clon. 3.3 Visualización de fluorescencia de células transfectadas. Lugar de 12 y placa en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido, y examinar las células para la expresión de YFP. Compare la imagen de la CID y tome nota del número aproximado de células verdes. Esto proporciona una estimación de la eficiencia de transfección. 3.4 Preparación de los 24 y los platos y poli-D-lisina cubreobjetos recubiertos Limpia de 12 mm cubreobjetos de vidrio (Warner, CS-12R) agitando durante la noche con ellos Radiacwash, seguido de un lavado con agua destilada y agitación durante la noche en el 95% de etanol. Guarde el cubreobjetos limpios en el 70% de etanol hasta su uso. Coloque la tapa se desliza en una placa de Petri con etanol, etanol de fuego con las pinzas y el quemador, unad lugar en un pocillo de una placa estéril 24 también. Cubrir cada pocillo con 250 l de poli-D-lisina (PDL), solución [0,2 mg / ml] y dejar que la cubierta se desliza reposar toda la noche sumergido en una solución estéril PDL bajo el capó. Envuelva la placa de 24 pocillos en Parafilm para evitar la evaporación. A la mañana siguiente, aspirar y lavar PDL 2x con agua estéril. Deja las placas para secarse bajo el capó, luego cubra. Los 24 platos bien con cubreobjetos recubiertos pueden ser envueltos con papel de aluminio estéril y se almacena a temperatura ambiente durante semanas. 3.5 Revestimiento células transfectadas HEK293T en la cubierta se desliza 24 horas después de la transfección las células, dividida en 24 y plato (~ 4 x 10 3 células / pocillo) con cubierta de cristal se desliza recubiertos con poli-D-lisina. Nota: Las células transfectadas se puede utilizar hasta 24-72 horas después de la transfección. Las células se dividen para proporcionar hojas individuales cobertura de patch clamp experimentos de electrofisiología. 4. Electrofisiología 4.1 Preparación de Soluciones Extracelular (bañera) solución: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM de MgCl 2 y 10 mM HEPES (pH 7,4 conjunto con NaOH). Alícuota 20K baño de solución y añadir moduladores adecuados <ul><li> 20K + Ba 2 +: solución que contiene 1 mM BaCl 2: un inhibidor específico de las entradas de corrientes de rectificar </li><li> 20K + Carbachol: solución con M Carbachol 5: un agonista M2R específicos; parejas M2R a proteínas G que se abren los canales GIRK </li><li> 20K + etanol: baño de solución que contiene 100 mM EtOH para activar los canales GIRK directamente </li></ul> Soluciones de baño en lugar de jeringas (contenedores de solución) del sistema de intercambio de perfusión rápida. Nota: Usamos una pizca Warner sistema de válvulas de control de las soluciones de baño. Tubería de PE se recomienda. Internos / electrodo solución: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM MgCl2, 10 mM HEPES (pH 7,4) con 2,5 mM K 2 ATP y 0,3 M Li 2 GTP. Hacemos la solución de electrodos sin ATP y GTP. Hemos separado preparar alícuotas de la ATP y GTP, que se almacenan a -80 ° C, y añadir a la solución de electrodos en el día del experimento. Mantenemos una jeringa con la solución definitiva del electrodo en el hielo para preservar la ATP / GTP. Nos filtro estéril (0,2 micras), las soluciones internas / externas para inhibir el crecimiento microbiano y reducir la posibilidad de obstrucción de las trompas y el electrodo. 4.2 electrodos tira Usamos Narishige dos pasos tirador vertical y electrodo de vidrio borosilicato de Warner Instrumento (1,5 mm de diámetro exterior, diámetro interior de 0,86 mm y 7,5 cm de longitud) para obtener electrodos con 3.7 mW de la resistencia cuando se llena con solución intracelular. Nota: Es necesario determinar experimentalmente los parámetros para el extractor de electrodos y el tipo de electrodo de vidrio en el laboratorio. Para nuestro extractor vertical, se utiliza un ajuste de calor de 60,2 para el primer tirón y 43 ~ para el segundo tirón. 4,3 de células enteras patch clamp <ol><li> Monte cubreobjetos en una placa de 35 mm con una pequeña cantidad de vaselina, cubrir con una solución externa y el plato lugar en el escenario de un microscopio de fluorescencia invertido. Use DIC para concentrarse y encontrar las células, cambiar a YFP fluorescencia para localizar YFP células positivas. </li><li> Posición de la punta del colector de la perfusión cerca de una célula verde (20-30 m de la célula de interés longitud de la fibra = 2.3 de diferencia). </li><li> Rellene los electrodos con solución, se adhieren a la headstage de Axopatch amplificador 200B (Axon Instruments) con los siguientes valores iniciales: Ganancia 1, Configuración: conjunto de células β = 1, el modo V-clamp. </li><li> Aplique una presión positiva en el electrodo para evitar la obstrucción de la pipeta, y el uso manipulador de colocar la punta del electrodo justo por encima de la celda. </li><li> A cero la posibilidad de una pipeta, seleccione el botón de prueba del sello para ofrecer un escalón de tensión de prueba. El paso 5 mV de tensión rectangular aparecerá en la ventana de prueba Sello de Clampex. Ajuste el potenciómetro con una pipeta de desplazamiento en el amplificador para que la línea de base actual a 0 nA. Por otra parte, poner a cero el potencial de la pipeta al cambiar el modo de amplificador de selección para el modo V-track y el mando del metro de Vtrack y utilizar el potenciómetro con una pipeta de desplazamiento en el amplificador para que el voltaje en la pantalla del medidor amplificador a &quot;0.00&quot;. </li><li> Revise la resistencia del electrodo con el comando sello de calidad de la Clampex 8,2 software (debe ser 7.3 MW). </li><li> Abrir un archivo de protocolo guardado o cree un nuevo protocolo. Para abrir el archivo de protocolo de seleccionar desde el menú principal Adquirir Protocolo luego Abrir y seleccione un archivo de protocolo de tensión salvo. Para este experimento, el protocolo ha sido creada para mantener el potencial de membrana de-40mV, entregar un solo escalón de tensión 50 ms a 100 mV y 40 mV rampa de más de 200 ms. Este protocolo se ejecuta cada dos segundos. El protocolo de rampa permite la observación de la rectificación de una posible regresión y hacia el interior de los canales GIRK. Para los canales iónicos dependientes de voltaje, un escalón de tensión rectangular puede ser más apropiado. </li><li> Celular con enfoque de ajuste fino del manipulador, de liberación de presión positiva, después de tocar la superficie de la célula aplicar presión negativa, y el monitor aumento de la resistencia en la ventana del osciloscopio Sello de prueba. Una vez que la resistencia está en el rango GΩ, el electrodo se ha sellado en la membrana (Gigaseal ha formado). </li><li> Aplicar un pulso de presión negativa para romper la membrana celular y tener acceso a la célula. Una vez en la configuración de célula completa, se registrará un aumento corrientes capacitivas. </li><li> Cambiar a la prueba de membrana en Clampex y anote la resistencia acceso a Ra, Rm resistencia de la membrana, la membrana Cm capacidad y verificar por el ojo de la forma exponencial de la curva teórica a la corriente capacitiva real. Capacitancia de la membrana es proporcional al tamaño de la celda y se utilizará más adelante para calcular la densidad de corriente. </li><li> Volver al sello de calidad, conjunto V de salida (potencial de membrana) a -40 mV y un filtro de 10 kHz </li><li> Compensar la capacitancia de la membrana y la resistencia en serie en el amplificador con los siguientes pasos: <ol class="lalpha"><li> Cambie el interruptor de la PAC CELULAR TODO en. Ajuste de la PAC de células enteras y marca resistencia en serie de ida y vuelta, hasta que llegue un pulso de prueba plana. También puede ser necesario ajustar la perilla pipeta de capacidad de la PAC FAST. </li><li> Gire la perilla% de predicción para aproximadamente el 60-80%, una vez más re-ajuste de la PAC de células enteras y el dial de la resistencia en serie (es posible que tengas que ajustar la capacitancia pipeta una rápida compensación mando de la PAC también). </li><li> Encienda% COMP-al 100% sin oscilación de la célula, mientras trata de mantener el pulso de plano por el reajuste de la PAC de células enteras y la resistencia en serie (es posible que tengas que ajustar la capacitancia pipeta mando de compensación de la PAC rápido también). Ajuste el retraso por la reducción de la constante de tiempo. </li><li> Anote los valores de Cm (capacitancia de la membrana), R (resistencia en serie), COMP%, PRED% y el tiempo de retardo establecido en el amplificador en el cuaderno. El CM y R debe ser aproximadamente la misma que la Cm y Rm medido en la prueba de la membrana de arriba. </li></ol></li><li> En la válvula de solución externa para controlar la solución del baño. Ajuste el amplificador de 8 polos del filtro de Bessel a 2 kHz, abra un protocolo de fijación de voltaje y corrientes comenzar la grabación. </li><li> Registramos corrientes GIRK utilizando un protocolo de rampa que los pasos a -100 mV a 50 ms y después de las rampas de 100 mV a 40 mV más de 200 ms y se entrega cada 2 segundos. El protocolo de rampa permite la observación del potencial de inversión y la propiedad de rectificación hacia el interior de los canales GIRK. A temperatura ambiente (22-25 ° C), la GIRK actual debe invertir cerca de -50 mV (con KCl 20 mM en el baño), que está cerca del potencial de equilibrio calculado para K (E K = -50 mV), entonces quedan bastante plana a potenciales positivos a E K. </li><li> Protocolo experimental: Después de grabar una línea de base estable, cambie a la solución de 20K + Carbachol y esperar a pico de la respuesta, vuelva a la solución de baño de 20K, a continuación, aplicar 20K + etanol y esperar la respuesta de pico, y luego cambiar a la solución del baño 20K, y finalmente 20K + Ba 2 + solución. Durante la aplicación de estos medicamentos que se producirán cambios en la amplitud de GIRK corrientes (más pronunciada a -100 mV). Anote el número de traza correspondiente a la aplicación de diferentes soluciones extracelular en el cuaderno. Un archivo de Clampfit single contendrá todos los barridos de todo el experimento. </li></ol> 5. Análisis de Datos Usamos Clampfit 9.2 de software para analizar los datos de las corrientes GIRK a -100 mV. <ol><li> Abra el archivo con la grabación, sitúa el cursor a -100 mV. Por defecto, se podrá ver todos los vestigios superpuestos en la pantalla. Pulsando el botón &quot;Escribir cursores&quot; icono que va a crear hojas de cálculo tipo Excel con datos numéricos. </li><li> X por asignar a la columna número de seguimiento y Y a la columna del cursor y pulsar &quot;Crear gráfico&quot; icono usted puede dibujar un gráfico de tiempo-curso del experimento. </li><li> Calcular basal actual restando actual en presencia de Ba 2 + de la corriente registrado en la solución de perfusión externos solo (&quot;actual 20K&quot; menos &quot;20K + Ba 2 + actual&quot;). Calcular las corrientes inducidas por restar actual basal de 20K de las corrientes activadas (&quot;20K + Carbachol actual&quot; menos &quot;20K actual&quot;, &quot;20K + etanol actual&quot; menos &quot;actual 20K&quot;). Calcular la densidad de corriente (pA / pF), dividiendo el actual capacitancia de la membrana (leer directamente desde el amplificador). Calcular la activación por ciento al dividir las corrientes inducidas por las corrientes de base y multiplicando por 100. </li></ol> 6. Resultados representante Usted debe ser capaz de registro actual de las células transfectadas con los canales de tipo salvaje. Para medir los canales GIRKd en la solución extracelular que contiene 20 mM de K + (y 145 mM de K + intracelular) que debe exhibir rectificación fuerte hacia adentro y un potencial de inversión de ~ -50 mV, que es una propiedad esencial de los canales de potasio. La corriente de tipo salvaje se incrementará en gran medida de aplicación de carbacol (3-5 veces más que basal actual) y responden de manera similar a la de etanol 100 mM. Nota: la convención de signos para electrofisiología es que la corriente hacia el interior es negativo y la corriente hacia el exterior es positiva. Para la mutación L257W en el bolsillo de unión de alcohol GIRK2, podrás ver las respuestas atenuadas tanto carbacol y el etanol. Esto sugiere que la L 257 está implicado en el alcohol y la activación de la proteína G de GIRK2 canales. Para más ejemplos de los resultados de GIRK2 mutagénesis, vea la publicación reciente de Aryal et al. 1. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig1.jpg" alt="Figura 1" /> Figura 1. Ventana de Clampfit 8.0 muestra el archivo de datos para el registro de GIRK2 de tipo salvaje. Izquierda del panel superior muestra superpuesta barre registrado en respuesta a un protocolo de rampa de voltaje en la presencia de diferentes soluciones externas bah. El cursor se coloca en un -100 mV. Los valores de cursor se escriben en la hoja de cálculo (panel derecho). Panel inferior izquierdo muestra la representación gráfica del número de barrido frente, actual. Tenga en cuenta el aumento de la corriente (flecha hacia abajo) con etanol (EtOH) y carbacol (CARB) y la inhibición de la corriente con Ba 2 +. <img src="/files/ftp_upload/2189/2189fig2.jpg" alt="Figura 2" /> Figura 2. Descripción de la ventana de Clampfit 8.0 muestra el archivo de datos para un mutante GIRK2-L257W grabación. Son los mismos que en la Figura 1. Tenga en cuenta la pérdida de carbacol (CARB) y la reducción de la activación de EtOH-corrientes inducidas en los canales de mutantes.

<ol>
	<li>Aryal, P., Dvir, H., Choe, S., Slesinger, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+discrete+alcohol+pocket+involved+in+GIRK+channel+activation.">A discrete alcohol pocket involved in GIRK channel activation.</a> Nature Neurosci. 12, 988-995 (2009).</li><li>Panchenko, V. A., Glasser, C. R., Mayer, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+similarities+between+glutamate+receptor+channels+and+K++channels+examined+by+scanning+mutagenesis.">Structural similarities between glutamate receptor channels and K+ channels examined by scanning mutagenesis.</a> J Gen Phys. 117, 345-360 (2001).</li><li>Doyle, D. A., Cabral, M. o. r. a. i. s., Pfuetzner, J., Kuo, R. A., Gulbis, A., Cohen, J. M., Chait, S. L., &amp;amp, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+potassium+channel:+molecular+basis+of+K++conduction+and+selectivity.">The structure of the potassium channel: molecular basis of K+ conduction and selectivity.</a> Science. 280, 69-77 (1998).</li><li>Nishida, M., Cadene, M., Chait, B. T., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+a+Kir3.1-prokaryotic+Kir+channel+chimera.">Crystal structure of a Kir3.1-prokaryotic Kir channel chimera.</a> EMBO J. 26, 4005-4015 (2007).</li><li>Tao, X., Avalos, J. L., Chen, J., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+eukaryotic+strong+inward-rectifier+K++channel+Kir2.2+at+3.1+&amp;Aring;+resolution.">Crystal structure of the eukaryotic strong inward-rectifier K+ channel Kir2.2 at 3.1 &amp;Aring; resolution.</a> Science. 326, 1668-1674 (2009).</li></ol>

La mutagénesis dirigida es un método clásico para estudiar relaciones estructura-función de los canales iónicos. Se basa en la premisa de que al cambiar un residuo crítico de los canales iónicos uno debe ser capaz de observar los cambios pronunciados en la función del canal. Por el contrario, muchas mutaciones que no son críticas en la posición pueden ser introducidos sin perturbaciones importantes en la función del canal. Por lo general, el residuo en cuestión es la primera mutación a alanina, una pequeña organización no polares de aminoácidos, seguida por la mutación de triptófano, el más grande de los aminoácidos 2. Si el residuo es importante para la función del canal, ambas mutaciones se va a cambiar la actividad del canal. Si un residuo menos esencial está mutado, los efectos de la mutación, especialmente a la alanina son a menudo insignificantes. Mutaciones triptófano son más propensos a causar cambios debido a los obstáculos estéricos asociados con el tamaño de triptófano. A menudo, cuando la información estructural que falta, la mutación sistemática a alanina y triptófano dentro de un fragmento de un canal (llamado alanina o escanear triptófano) puede ser utilizado para localizar restos críticos. Es importante señalar que varios clones con diferentes mutaciones puntuales se pueden preparar en paralelo que permite probar múltiples residuos dentro de un tiempo relativamente corto. Recientemente, múltiples estructuras cristalinas de los canales se han convertido en disponibles 3,4,5. Se pueden utilizar para proponer posibles residuos clave para ser probados utilizando el procedimiento descrito en este protocolo. Las mediciones de tipo salvaje del canal debe acompañar siempre a la medición de un canal de mutantes para servir como un control positivo para asegurar que los experimentos de transfección y electrofisiológicos se realizaron correctamente. Las mutaciones puntuales pueden conducir a la falta de una corriente funcional, similares a la regulación actual de tipo salvaje o alteración de la actividad del canal. La falta de corriente medible puede ser debido al tráfico indebido de plegado o alterada. En tal caso, puede ser útil para averiguar si el canal de tráficos correctamente a la superficie mediante un ensayo de inmunofluorescencia biotinilación o contra etiqueta extracelular (sin permeabilización celular) para distinguir entre los no funcionales de canales en la membrana plasmática y los canales de retenido en el interior de la célula . Por último, es aconsejable investigar no sólo la actividad basal del canal, sino también las consecuencias de la mutación en la regulación del canal. Diferentes mecanismos de modulación de la función del canal podría estudiarse en función del canal iónico de interés, incluyendo la regulación de las proteínas G, PIP2, iones, la concentración de ATP, la fosforilación (con tirosina, serina treonina o mutación), ubiquitinación o sumoylation (con la mutación de lisina) y abridores de canal directo o bloqueadores.

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 <div>
 <table border="1">
 <thead>
 <tr>
 <td>Material Name</td>
 <td>Type</td>
 <td>Company</td>
 <td>Catalogue Number</td>
 <td>Comment</td>
 </tr>
 </thead>
 <tbody>
 
<tr>
<td>Chemicals</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sigma</td>
<td>Varies</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Mini Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>27104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Radiacwash</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Biodex</td>
<td>005-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Poly-D-lysine hydrobromide</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>BD Biosciences</td>
<td>CB40210</td>
<td>Poly-L-lysine can also be used</td>
</tr>
<tr>
<td>Maxi Prep Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>12263</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>QuickChange XL II Site Directed Mutagenesis Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Stratagene</td>
<td>200512-5</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Lipofectamine 2000</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11668-027</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cover slips &#x02C6;&#x2026; 12 mm</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>CS-12R</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Capillary Glass Tubing Borosilicate-standard wall</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>G150-3</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td><a href="http://www.leica-microsystems.com/products/light-microscopes/clinical/inverted-microscopes/details/product/leica-dmi3000-b/" target="_blank">Inverted fluorescence microscope</a></td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>DMI3000 B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrophysiology</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Nikon/ Leica/ Zeiss</td>
<td>Any inverted DIC (Hoffmann) microscope with fluorescence</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Axon Axopatch 200B amplifier</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Perfusion system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Warner Instruments</td>
<td>VC-6 Perfusion MM-6</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>Digidata 1320 digitizer</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Manipulators</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Sutter Instruments</td>
<td>Manipulator: MP-85</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Electrode Puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Narishige</td>
<td>PC10 vertical electrode puller</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Isolation Table</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Technical Manufacturing Corporation</td>
<td>Air table</td>
<td>&nbsp;</td> </tbody>
 </table>
 </div>

mutagenesis and functional analysis of ion channels heterologously expressed in mammalian cells

Vamos a demostrar la forma de estudiar los efectos funcionales de la introducción de una mutación puntual en un canal iónico. Se estudia la proteína G-dependientes de potasio hacia el interior rectificación (en adelante, GIRK) canales, que son importantes para la regulación de la excitabilidad de las neuronas. Hay cuatro diferentes subunidades de mamíferos canal GIRK (GIRK1-GIRK4) - nos centramos en GIRK2 porque forma una homotetrámero. La estimulación de los diferentes tipos de acoplados a proteínas G-receptores (GPCR), como la de los receptores muscarínicos (M2R), conduce a la activación de los canales GIRK. El alcohol también activa directamente los canales GIRK. Vamos a mostrar cómo la mutación de un aminoácido, específicamente, el cambio de uno o más nucleótidos en el cDNA del canal GIRK. Esta secuencia de ADNc mutado será amplificado en bacterias, purifica, y la presencia de la mutación puntual se confirmó por secuenciación del ADN. El ADNc de la mutante y de tipo salvaje canales GIRK se transfectaron en células embrionarias humanas de riñón HEK293T cultivadas in vitro. Por último, el conjunto de células patch-clamp electrofisiología se utilizarán para estudiar las corrientes de potasio macroscópico a través de los canales GIRK expresó ectópica de tipo salvaje o mutado. En este experimento, vamos a examinar el efecto de una mutación L257W en GIRK2 canales en la activación M2R-dependientes y alcohólicos.

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Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Mutagénesis y análisis funcional de los canales iónicos heteróloga se expresa en células de mamífero

We will demonstrate how to study the functional effects of introducing a point mutation in an ion channel. We study G protein-gated inwardly rectifying ...

mutagenesis-functional-analysis-ion-channels-heterologously-expressed

Research

JoVE Journal

Biology

17.3K vistas.  Salk Institute for Biological Studies. Vamos a demostrar la forma de estudiar el efecto de un único punto de mutación en la función de un canal iónico.

Video: Mutagenesis and Functional Analysis of Ion Channels Heterologously Expressed in Mammalian Cells

Patch Clamp Recording of Ion Channels Expressed in  Xenopus Oocytes

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological measurement of single or multiple ion channels in cells. This technique can be applied to ion channels in both their native environment and expressed in heterologous cells, such as oocytes harvested from the African clawed frog, Xenopus laevis. Here, we describe the well-established technique of patch clamp recording from Xenopus oocytes. This technique is used to measure the properties of expressed ion channels either in populations (macropatch) or individually (single-channel recording). We focus on techniques to maximize the quality of oocyte preparation and seal generation. With all factors optimized, this technique gives a probability of successful seal generation over 90 percent. The process may be optimized differently by every researcher based on the factors he or she finds most important, and we present the approach that have lead to the greatest success in our hands.

This is intended as an introduction to patch clamp recording from Xenopus laevis oocytes. It covers vitelline membrane removal, formation of a gigaohm seal (gigaseal), and the optional conversion of the patch to the outside-out topology.

Parche de grabación Clamp de canales iónicos expresados ​​en ovocitos de Xenopus

Since its development by Sakmann and Neher 1, 2, the patch clamp has become established as an extremely useful technique for electrophysiological ...

Investigación

Biología

Pulse-chase Analysis of N-linked Sugar Chains from Glycoproteins in Mammalian Cells

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although this modification was implicated in several biological processes, additional aspects of its function are emerging, with recent evidence of its role in the production of signals for glycoprotein quality control and trafficking. Thus, phenomena related to N-linked glycans and their processing are being intensively investigated. Methods that have been recently developed for proteomic analysis have greatly improved the characterization of glycoprotein N-linked glycans. Nevertheless, they do not provide insight into the dynamics of the sugar chain processing involved. For this, labeling and pulse-chase analysis protocols are used that are usually complex and give very low yields. We describe here a simple method for the isolation and analysis of metabolically labeled N-linked oligosaccharides. The protocol is based on labeling of cells with [2-3H] mannose, denaturing lysis and enzymatic release of the oligosaccharides from either a specifically immunoprecipitated protein of interest or from the general glycoprotein pool by sequential treatments with endo H and N-glycosidase F, followed by molecular filtration (Amicon). In this method the isolated oligosaccharides serve as an input for HPLC analysis, which allows discrimination between various glycan structures according to the number of monosaccharide units comprising them, with a resolution of a single monosaccharide. Using this method we were able to study high mannose N-linked oligosaccharide profiles of total cell glycoproteins after pulse-chase in normal conditions and under proteasome inhibition. These profiles were compared to those obtained from an immunoprecipitated ER-associated degradation (ERAD) substrate. Our results suggest that most NIH 3T3 cellular glycoproteins are relatively stable and that most of their oligosaccharides are trimmed to Man9-8GlcNAc2. In contrast, unstable ERAD substrates are trimmed to Man6-5GlcNAc2 and glycoproteins bearing these species accumulate upon inhibition of proteasomal degradation.

We describe a method for analysis of the alteration of N-linked glycans through the early life of glycoproteins after their biosynthesis in mammalian cells. This is achieved by pulse-chase analysis of metabolically labeled glycans, enzymatic release from glycoproteins and examination by HPLC.

Pulso-caza de análisis de cadenas de azúcares unidos a N de glicoproteínas en células de mamífero

Attachment of the Glc3Man9GlcNAc2 precursor oligosaccharide to nascent polypeptides in the ER is a common modification for secretory proteins. Although ...

Analysis of DNA Double-strand Break (DSB) Repair in Mammalian Cells

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death. Cells repair DSBs using two major pathways: nonhomologous end joining (NHEJ) and homologous recombination (HR). Perturbations of NHEJ and HR are often associated with premature aging and tumorigenesis, hence it is important to have a quantitative way of measuring each DSB repair pathway. Our laboratory has developed fluorescent reporter constructs that allow sensitive and quantitative measurement of NHEJ and HR. The constructs are based on an engineered GFP gene containing recognition sites for a rare-cutting I-SceI endonuclease for induction of DSBs. The starting constructs are GFP negative as the GFP gene is inactivated by an additional exon, or by mutations. Successful repair of the I-SceI-induced breaks by NHEJ or HR restores the functional GFP gene. The number of GFP positive cells counted by flow cytometry provides quantitative measure of NHEJ or HR efficiency.

Analysis of DNA Double-strand Break DSB Repair in Mammalian Cells

This article describes GFP-based fluorescence in vivo assays that separately quantify homologous recombination and nonhomologous end joining in mammalian cells.

El análisis de ADN de doble cadena Break (OSD) de reparación en células de mamífero

DNA double-strand breaks are the most dangerous DNA lesions that may lead to massive loss of genetic information and cell death.  Cells repair DSBs using ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch clamp y técnicas de perfusión para el estudio de los canales iónicos expresados ​​en Xenopus Ovocitos

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Optimized Transfection Strategy for Expression and Electrophysiological Recording of Recombinant Voltage-Gated Ion Channels in HEK-293T Cells

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) is a ubiquitous research strategy. HEK-293T cells must be plated onto glass coverslips at low enough density so that they are not in contact with each other in order to allow for electrophysiological recording without confounding effects due to contact with adjacent cells. Transfected channels must also express with high efficiency at the plasma membrane for whole-cell patch clamp recording of detectable currents above noise levels. Heterologous ion channels often require long incubation periods at 28&deg;C after transfection in order to achieve adequate membrane expression, but there are increasing losses of cell-coverslip adhesion and membrane stability at this temperature. To circumvent this problem, we developed an optimized strategy to transfect and plate HEK-293T cells. This method requires that cells be transfected at a relatively high confluency, and incubated at 28&deg;C for varying incubation periods post-transfection to allow for adequate ion channel protein expression. Transfected cells are then plated onto glass coverslips and incubated at 37&deg;C for several hours, which allows for rigid cell attachment to the coverslips and membrane restabilization. Cells can be recorded shortly after plating, or can be transferred to 28&deg;C for further incubation. We find that the initial incubation at 28&deg;C, after transfection but before plating, is key for the efficient expression of heterologous ion channels that normally do not express well at the plasma membrane. Positively transfected, cultured cells are identified by co-expressed eGFP or eGFP expressed from a bicistronic vector (e.g. pIRES2-EGFP) containing the recombinant ion channel cDNA just upstream of an internal ribosome entry site and an eGFP coding sequence. Whole-cell patch clamp recording requires specialized equipment, plus the crafting of polished recording electrodes and L-shaped ground electrodes from borosilicate glass. Drug delivery to study the pharmacology of ion channels can be achieved by directly micropipetting drugs into the recording dish, or by using microperfusion or gravity flow systems that produce uninterrupted streams of drug solution over recorded cells.

Reliable method for highly efficient in vitro expression and subsequent electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T).

Estrategia de transfección optimizados para la expresión y el registro electrofisiológico de los canales iónicos recombinantes del voltaje en las células HEK-293T

The in vitro expression and electrophysiological recording of recombinant voltage-gated ion channels in cultured human embryonic kidney cells (HEK-293T) ...

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although the nuclear export of mRNA has been studied extensively in Xenopus oocytes1 and genetically tractable organisms such as yeast2 and the Drosophila derived S2 cell line3, few studies had been conducted in mammalian cells. Furthermore the kinetics of mRNA export in mammalian somatic cells could only be inferred indirectly4,5. In order to measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian tissue culture cells, we have developed an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization (FISH). These assays have been used to demonstrate that in mammalian cells, the majority of mRNAs are exported in a splicing dependent manner6,7, or in manner that requires specific RNA sequences such as the signal sequence coding region (SSCR) 6. In this assay, cells are microinjected with either in vitro synthesized mRNA or plasmid DNA containing the gene of interest. The microinjected cells are incubated for various time points then fixed and the sub-cellular localization of RNA is assessed using FISH. In contrast to transfection, where transcription occurs several hours after the addition of nucleic acids, microinjection of DNA or mRNA allows for rapid expression and allows for the generation of precise kinetic data.

Here we describe an assay that employs the power of microinjection coupled with fluorescent in situ hybridization in order to accurately measure the nuclear export kinetics of mRNA in mammalian somatic cells.

Análisis de la cinética de exportación nuclear de ARNm en células de mamífero por microinyección

In eukaryotes, messenger RNA (mRNA) is transcribed in the nucleus and must be exported into the cytoplasm to access the translation machinery. Although ...

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular signatures, or to evolve proteins in the laboratory. Here, we present a protocol that allows the generation of large (>1011) mutant libraries for a given target sequence. This method is based on replication of a ColE1 plasmid encoding the desired sequence by a low-fidelity variant of DNA polymerase I (LF-Pol I). The target plasmid is transformed into a mutator strain of E. coli and plated on solid media, yielding between 0.2 and 1 mutations/kb, depending on the location of the target gene. Higher mutation frequencies are achieved by iterating this process of mutagenesis. Compared to alternative methods of mutagenesis, our protocol stands out for its simplicity, as no cloning or PCR are involved. Thus, our method is ideal for mutational labeling of plasmids or other Pol I templates or to explore large sections of sequence space for the evolution of activities not present in the original target. The tight spatial control that PCR or randomized oligonucleotide-based methods offer can also be achieved through subsequent cloning of specific sections of the library. Here we provide protocols showing how to create a random mutant library and how to establish drug-based selections in E. coli to identify mutants exhibiting new biochemical activities.

Mutagenesis and Functional Selection Protocols for Directed Evolution of Proteins in E. coli

Here we demonstrate a simple protocol to create a random mutant library for a given target sequence. We show how this method, which is performed in vivo in Escherichia coli, can be coupled with functional selections to evolve new enzymatic activities.

Mutagénesis y funcional protocolos de selección de la evolución dirigida de proteínas en E. coli</em

The efficient generation of genetic diversity represents an invaluable molecular tool that can be used to label DNA synthesis, to create unique molecular ...

Analysis of Cell Cycle Position in Mammalian Cells

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of cell proliferation underlies the pathology of diseases like cancer. As such there is great need to be able to investigate cell proliferation and quantitate the proportion of cells in each phase of the cell cycle. It is also of vital importance to indistinguishably identify cells that are replicating their DNA within a larger population. Since a cell&prime;s decision to proliferate is made in the G1 phase immediately before initiating DNA synthesis and progressing through the rest of the cell cycle, detection of DNA synthesis at this stage allows for an unambiguous determination of the status of growth regulation in cell culture experiments.
DNA content in cells can be readily quantitated by flow cytometry of cells stained with propidium iodide, a fluorescent DNA intercalating dye. Similarly, active DNA synthesis can be quantitated by culturing cells in the presence of radioactive thymidine, harvesting the cells, and measuring the incorporation of radioactivity into an acid insoluble fraction. We have considerable expertise with cell cycle analysis and recommend a different approach. We Investigate cell proliferation using bromodeoxyuridine/fluorodeoxyuridine (abbreviated simply as BrdU) staining that detects the incorporation of these thymine analogs into recently synthesized DNA. Labeling and staining cells with BrdU, combined with total DNA staining by propidium iodide and analysis by flow cytometry1 offers the most accurate measure of cells in the various stages of the cell cycle. It is our preferred method because it combines the detection of active DNA synthesis, through antibody based staining of BrdU, with total DNA content from propidium iodide. This allows for the clear separation of cells in G1 from early S phase, or late S phase from G2/M. Furthermore, this approach can be utilized to investigate the effects of many different cell stimuli and pharmacologic agents on the regulation of progression through these different cell cycle phases.
In this report we describe methods for labeling and staining cultured cells, as well as their analysis by flow cytometry. We also include experimental examples of how this method can be used to measure the effects of growth inhibiting signals from cytokines such as TGF-&beta;1, and proliferative inhibitors such as the cyclin dependent kinase inhibitor, p27KIP1. We also include an alternate protocol that allows for the analysis of cell cycle position in a sub-population of cells within a larger culture5. In this case, we demonstrate how to detect a cell cycle arrest in cells transfected with the retinoblastoma gene even when greatly outnumbered by untransfected cells in the same culture. These examples illustrate the many ways that DNA staining and flow cytometry can be utilized and adapted to investigate fundamental questions of mammalian cell cycle control.

Determining the cell cycle position of a population of cells, or understanding how signals affect proliferation, can be readily measured by flow cytometry using this protocol. We report a simple experimental approach to staining cells and quantifying their position in the cell cycle.

Análisis de la posición del ciclo celular en células de mamífero

The regulation of cell proliferation is central to tissue morphogenesis during the development of multicellular organisms. Furthermore, loss of control of ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

Inducción y Análisis de epitelial a mesenquimal de transición

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Isolation and Functional Analysis of Mitochondria from Cultured Cells and Mouse Tissue

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of cell heath due to their role in both cell metabolism and energy production as well as control of apoptosis. Therefore, direct evaluation of isolated mitochondria and mitochondrial perturbation offers the ability to determine if organelle-specific (dys)function is occurring. The methods described in this protocol include isolation of intact, functional mitochondria from HEK cultured cells and mouse liver and spinal cord, but can be easily adapted for use with other cultured cells or animal tissues. Mitochondrial function assessed by TMRE and the use of common mitochondrial uncouplers and inhibitors in conjunction with a fluorescent plate reader allow this protocol not only to be versatile and accessible to most research laboratories, but also offers high throughput.

Comparison of mitochondrial membrane potential between samples yields valuable information about cellular status. Detailed steps for isolating mitochondria and assessing response to inhibitors and uncouplers using fluorescence are described. The method and utility of this protocol are illustrated by use of a cell culture and animal model of cellular stress.

Aislamiento y análisis funcional de las mitocondrias de las células cultivadas y ratón de Tejidos

Comparison between two or more distinct groups, such as healthy vs. disease, is necessary to determine cellular status. Mitochondria are at the nexus of ...