La lignina es un heteropolímero complejo formado por tres monolignoles. Es el segundo polímero más abundante en la tierra junto a la celulosa. Aquí, demostramos el método de ácido tioglicólico, que es el método más confiable para la estimación del contenido de lignina.
Este método se basa en el principio de que la lignina se une al ácido tioglicólico a través de enlaces de tioéter. Además, dividimos este protocolo en cinco fases. En la primera fase, preparamos el material vegetal.
En la segunda fase, aislamos el extracto insoluble del alcohol. En la tercera fase, precipitamos lignina usando ácido tioglicólico y condiciones ácidas. En la cuarta fase, preparamos la curva estándar de lignina utilizando lignina de bambú industrial.
Finalmente, en la quinta fase, estimamos el contenido de lignina utilizando la curva estándar preparada en la cuarta fase. El material vegetal se recoge, se voltean las macetas para separar las raíces, se lasvan a fondo en agua, se secan al aire durante dos días, se transfieren a recipientes etiquetados y se incuban en la incubadora a 49 grados centígrados durante una semana a 10 días. Usando tijeras, el tejido se corta aún más en piezas de tamaño de 1 mm a 3 mm.
Alternativamente, la amoladora de biomasa se utiliza para aplastar los tejidos de las plantas. Utilice el tejido radicular Encienda la amoladora de biomasa recoger el polvo triturado en recipientes pre-etiquetados. Del mismo modo, repita para el tejido del tallo y el tejido de la hoja.
El polvo triturado se carga en el jarrón de molienda que luego se colocan en el molino congelador Y ejecutar el molino congelador a razón de 10 CP velocidad durante tres ciclos. Pesar 20 mg del polvo de tejido molido y transferir a un tubo de 2 ml prefabricado. Anote el tubo vacío y el tubo con polvo de tejido y el polvo de tejido en su cuaderno de laboratorio.
Incubar los tubos con la tapa abierta a 60 grados centígrados durante una hora. Después de la incubación, añadir 1,8 ml de agua a cada centrífuga de vórtice de muestra a 15,000 RPM durante 10 minutos. Desechar el sobrenadante Añadir 1,8 ml de metanol.
Vórtice e incubar en un bloque precalentado de 60 grados centígrados durante 20 minutos Después de la incubación centrífuga a 15, 000 RPM durante 10 minutos. Repita este paso una vez más. Después de la centrifugación deseche el sobrenadante y seque los pellets en el secador al vacío durante dos o tres horas o hasta que el palet esté completamente seco.
Mida y registre el peso de cada tubo en su cuaderno de laboratorio para la estimación del contenido de lignina al final. También se incluye lignina de bambú industrial de control positivo en este punto a partir de 0,5 mg a 4 mg en triplicados. Añadir 1 ml de 3 ácidos clorhídrico normales, junto con cien microlitros de ácido glicólico a cada muestra vortex e incubar a 80 grados centígrados durante 3 horas.
Después de 3 horas de incubación transferirlos a un estante y dejar que se enfríe durante 10 minutos. luego centrífuga a 15, 000 RPM durante 10 minutos. Después de la centrifugación, el color de la solución se ve así.
Deseche el sobrenadante. Añadir 1 ml de agua. Vortex Centrifuge a 15, 000 RPM durante 10 minutos.
Deseche el sobrenadante. Añadir 1 ml de 1 hidróxido de sodio normal. Vórtice e incubar a 37 grados centígrados agitador durante la noche.
Después de la incubación durante la noche centrifugar los tubos a 15, 000 RPM durante 10 minutos. Transferir el sobrenadante fresco pre-etiquetado 2 ml tubos añadir 200 microlitros de ácido clorhídrico concentrado al sobrenadante. Mézclelos por inversión suave como se muestra aquí.
Incubarlos en el refrigerador a 4 grados centígrados durante la noche. Después de la incubación centrífuga a 15, 000 RPM durante 10 minutos. Deseche el sobrenadante.
Añadir 1 ml de hidróxido de sodio. Vórtice e incubar en la coctelera a temperatura ambiente durante 10 a 15 minutos. Utilice espectrofotómetro para recoger las lecturas de absorbancia 280 nanómetros, Tomar 2 microlitros de hidróxido de sodio como blanco ya que la lignina precipitada se disuelve en hidróxido de sodio.
Haga que el espacio en blanco sea cero. Del mismo modo, repita para las muestras. Utilice dos microlitros de cada muestra para recopilar las lecturas de absorbancia en su cuaderno de laboratorio.
Tome tres lecturas para cada muestra para tres réplicas técnicas. En la primera columna, tenemos el número de muestra. En la segunda columna, tenemos réplicas biológicas donde R1, R2, R3 representan tres réplicas biológicas de una línea experimental.
En la tercera columna, promediamos las lecturas de absorbancia obtenidas en 280 nanómetros. Se calculó el contenido de lignina en la cuarta columna utilizando la fórmula y=mx-c donde x es el promedio de OD.m y los valores de c se trazan a partir de la línea de regresión de la curva estándar preparada. La quinta columna es el peso después de los lavados de metanol y agua.
Así que esta es la forma en que se utiliza para la estimación del contenido de lignina en mg. Así dividimos el valor obtenido en la cuarta columna por quinta columna para obtener el valor por mg de lignina contenido en la sexta columna. Y este valor se multiplica por 1000 para obtener por gramo de peso de la pared celular.
Y el porcentaje de contenido de lignina se calcula dividiendo este valor por 1000 y multiplicando por 100. Finalmente, obtenemos la lignina media promediando la lignina de tres réplicas biológicas de cada línea experimental que se compararán con la media de otra línea experimental en forma de gráfico de barras para entender las diferencias en el contenido de lignina. También podemos aplicar la prueba t de student para probar su nivel de significancia.
En la columna A, tenemos lignina de bambú comercial, y luego el peso de la lignina de bambú que se tomó antes de TGA y sus respectivas lecturas de absorbancia a 280 nanómetros. Estos valores de la tabla A se utilizaron para trazar un gráfico disperso en la columna B, que nos da la línea de regresión con valores m y c. En C, se compararon los valores obtenidos mediante la curva estándar y la línea experimental de lignina de bambú industrial uno y dos se compararon en forma de gráfico de barras y el resultado es que muestran diferencia entre sí.
