Nuestro método ayuda a estudiar la cinética de una formación compleja de proteínas. Describe lo apretado que es un complejo proteico, y si la formación compleja de proteínas es interferido por otras proteínas. Esta técnica permite estudiar la interacción proteína-proteína de forma cuantitativa utilizando la fluorescencia como reportero, nuestro ensayo puede monitorear la asociación y desasociación de un complejo proteico en tiempo real.
Para empezar, diseñe el ensayo FRET a partir de los datos del complejo COL1 CAND1 de la base de datos de proteínas. Cargue la estructura en PyMOL, y luego vaya al menú del asistente y utilice la función de medición para estimar la distancia entre el primer aminoácido de CAND1 y el último aminoácido de COL1. A continuación, cargue el visor de espectros en línea y vea los espectros de excitación y emisión de 7-amino-4-metilcoumarina y FlASH simultáneamente.
AMC es el donante de FRET y FlASH es el aceptador FRET. Preparar las células con la proteína donante FRET siguiendo el protocolo de texto que lo acompaña. Luego, purifique el complejo COL1 sortase RBX1 añadiendo primero 50 mililitros de tampón de lisis a un pellet de células E. coli que expresen el complejo COL1 sortase RBX1.
Hielo las células sobre hielo con sonicación a 50% de amplitud. Alternar la alimentación durante tres minutos para que esté encendida un segundo y, a continuación, un segundo apagado para evitar el sobrecalentamiento de la muestra. Transfiera el izado celular resultante a un tubo de centrifugación de 50 mililitros y retire los desechos celulares por centrifugación a 25.000 veces g durante 45 minutos.
Luego, agregue el sobrenadante a cinco mililitros de cuentas de glutatión e incubarlos a cuatro grados Celsius para limpiar el licato celular. Después de la incubación, centrifugar la mezcla de izado de perlas a 1.500 veces g durante dos minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, retire el sobrenadante.
A continuación, lave las perlas con 5 mililitros de tampón de lelisis sin inhibidor de la proteasa. Después de centrifugar la solución, retire el sobrenadante. Ahora, agregue tres mililitros de tampón de lelisis a las cuentas lavadas y transfiera la suspensión del cordón a una columna vacía.
A la nueva columna, también agregue cinco mililitros de tampón de elución y luego incubar la columna durante 10 minutos y recoger el eluido. A continuación, añadir 200 microlitros de trombina a cinco miligramos por mililitro al eluido de las cuentas de glutatión. Después de una incubación nocturna a cuatro grados centígrados, diluya la muestra de proteína tres veces con el tampón A.Cargue la muestra de proteína en una columna de cromatografía de intercambio catiónico equilibrado Tampón A en punto cero cinco mililitros por minuto.
Luego, agregue un gradiente de cero a 50% del buffer B en el buffer A para eluir la proteína con un caudal de 1 mililitro por minuto. A continuación, acoja las fracciones de eluido que contienen la proteína donante FRET y consétela hasta dos mililitros de cinco puntos utilizando una membrana de ultrafiltración con un límite de 30 kilodalton. Ahora, agregue 7-amino-4-metilcoumarina al terminal c de COL1 a través de la transpeptidación mediada por clasificación cambiando primero el tampón en la muestra de proteína del donante FRET en el tampón de la clasificadoa usando una columna de desalado.
Para lograr esto, primero equilibre una columna de desaladora con 25 mililitros de búfer de clasificación. A continuación, cargue dos mililitros de cinco puntos de la solución de proteína del donante FRET en la columna y deseche el flujo a través. A continuación, eluda la muestra con tres mililitros de punto cinco de búfer de sortase y recoja el flujo a través.
En 900 microlitros del eluido, añadir 100 microlitros de 600 micromolares purificados sortase Una solución y 10 microlitros de un péptido GG-AMC de 25 mililitros. Incubar la mezcla de reacción a 30 grados celsius en la oscuridad durante la noche para generar COL1-AMC-RBX1. Ahora, cargue toda la muestra en la columna de cromatografía de exclusión de tamaño y eléjela con un punto cinco veces el volumen de columna del búfer.
Al final, alcála las fracciones eludas que contienen COL1-AMC-RBX1. Siga el protocolo de texto para preparar la proteína aceptador fret. Muchos de los pasos son similares a la preparación de proteínas del donante FRET.
Una vez terminado, prepare la solución FLASH CAND1. En primer lugar, añada un microlitros de la solución FlASH a 50 microlitros de la solución tetra-cys-CAND1 recién preparada. Mezclar bien las soluciones combinadas e incubar la mezcla a temperatura ambiente en la oscuridad durante una o dos horas para formar la solución FLASH CAND1.
En 300 microlitros de tampón FRET, añada COL1-AMC-RBX1 a una concentración final de 70 nanomolares y transfiera la solución a una cubeta. Coloque la cubeta en el portacuchillas de un fluoriómetro. Excite la muestra con luz de excitación de 350 nanómetros y escanee las señales de emisión de 400 a 600 nanómetros en incrementos de un nanómetro.
Luego, en 300 microlitros de buffer FRET, agregue COL1-AMC-RBX1 y FlASH-CAND1 a una concentración final de 70 nanomolares. Excite la muestra con luz de excitación de 350 nanómetros y escanee las señales de emisión de 400-600 nanómetros en incrementos de un nanómetro. Ajuste la luz de excitación a 350 nanómetros y utilice un filtro de paso de banda que permita pasar 450 nanómetros de luz de emisión y bloquee la luz de emisión de 500 a 650 nanómetros.
Con las válvulas de muestra en la posición de llenado, conecte una jeringa de tres mililitros llena de agua. A continuación, lave las dos jeringas de muestra con agua moviendo la unidad de la jeringa de muestra hacia arriba y hacia abajo varias veces, descartando el agua cuando haya terminado. A continuación, conecte una jeringa de tres mililitros llena de tampón FRET.
Lave las dos jeringas de muestra con el amortiguador FRET moviendo la unidad de la jeringa de muestra hacia arriba y hacia abajo varias veces, descartando el agua cuando haya terminado. Ahora, conecte una jeringa de tres mililitros y cargue la primera jeringa de muestra, jeringa A, con 100 col1-AMC-RBX1 nanomolares en el búfer FRET. A continuación, gire la válvula de muestra a la posición de accionamiento También, conecte una jeringa de tres mililitros a la jeringa B y cargue la jeringa B con 100 nanomolares de FlASH CAND1 en el búfer FRET y gire su válvula a la posición de accionamiento.
Abra el panel de control en adquirir en el software y registre la emisión de COL1-AMC en el transcurso de 60 segundos. Entonces, toma un solo tiro. Ajuste la disminución y las señales fluorescentes medidas con el tiempo de cada disparo a una sola curva exponencial.
Lave el sistema como se ha mostrado anteriormente y luego agregue una solución de 100 nanomolares COL1-AMC-RBX1 y 100 nanomolares FlASH CAND1 en el tampón FRET en la jeringa A.Conéctelo al sistema mientras está en la posición de llenado Cargue la jeringa A y luego gire la válvula de muestra a la posición de accionamiento. A continuación, cargue una solución de Skp1-Skp2 en la jeringa B.Conéctela al sistema mientras está en la posición de llenado. Cargue la jeringa B y, a continuación, gire la muestra a la posición de accionamiento.
En el software, vaya a adquirir y abra el panel de control. Configure el programa para registrar la emisión de COL1-AMC durante 30 segundos. Entonces toma un solo tiro.
Las señales de fluorescencia aumentan con el tiempo después de mezclar las soluciones de la jeringa A y la jeringa B.Cuando 70 nanomolares cada uno de COL1-AMC y FlASH CAND1 se mezclaron para generar FRET, dos picos de emisión estaban presentes en los espectros de emisión. Y el pico de COL1-AMC se hizo más bajo, y el pico de FlASH CAND1 se hizo más alto. Cuando se utilizó la longitud completa de CAND1 para el FRET, el pico del donante mostró una reducción del 10% en la intensidad.
Sin embargo, cuando CAND1 con su primera hélice truncada se utilizó la reducción de la intensidad máxima del donante se incrementó a 30%sugiriendo una mayor eficiencia FRET Para confirmar que los cambios de señal fueron resultado de FRET entre COL1-AMC y FlASH CAND1, el DONANTE FRET se mezcló con exceso de CAND1 sin etiquetar conocido como el Chase en el aceptador. Como resultado, el pico del donante se restauró por completo y el pico del aceptador disminuyó. Aquí se muestra una gráfica del valor K medio observado con la concentración CAND1 tras el análisis de regresión lineal.
Para medir la constante del complejo, se utilizaron 50 col1-AMC nanomolares en una serie de constantes de tasa de disociación observadas mezclando 50 col1-AMC nanomolares con concentraciones crecientes de FlASH CAND1. De forma similar a la medición de la constante on, se encontró la constante de disociación observada de COL1 y CAND1 mediante el seguimiento de la restauración de la señal del donante a lo largo del tiempo en el fluorómetro de flujo detenido. Aquí la señal del donante aumentó rápidamente y reveló un valor K observado de cero punto cuatro por segundo.
Por el contrario, cuando se añadió un búfer al complejo premontado, no se observó ningún aumento de señal que sugiriera que la rápida disociación de COL1 CAND1 fue activada por Skp1 Skp2. Asegúrese de minimizar la cantidad de luz a la que están expuestos las proteínas donantes y receptoras. Trate de mantener los fluoróforos en la oscuridad tanto como sea posible.
