Este método proporciona una alternativa eficiente al enfoque analógico convencional en la obtención de sobreproductores de aminoácidos. Esta técnica supera el método tradicional basado en analógico al proporcionar precisión, sensibilidad y alto rendimiento simultáneamente. Este método arroja nueva luz sobre la comprensión de las fuerzas de sobreproducción de aminoácidos y la traducción de codones raros y podría, teóricamente, aplicarse a todos los microorganismos.
Este protocolo se basa principalmente en operaciones experimentales moleculares básicas que son fáciles de seguir, pero pueden requerir múltiples ensayos para lograr la selección adecuada de cuerdas de esfuerzo. Una demostración visual de esta técnica ofrece una apreciación directa sobre el rendimiento de la selección y un sistema de cribado en la identificación de productores de aminoácidos. Para comenzar este procedimiento, agregue el vector en los fragmentos de marcador, sobre hielo, en una relación molar de uno a uno a siete microlitros de punto de mezcla de ensamblaje a un volumen total de diez microlitros.
Incubar a 50 grados centígrados durante una hora. Transforme cinco microlitros del producto de ensamblaje en 50 microlitros de células de componentes a 42 grados Celsius durante 30 segundos. Recupera las células en caldo Super Optimal con medio de represión catabolita a 37 grados centígrados durante una hora.
Luego, platéalos en medio de agar LB e incubar durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, utilice un kit comercial preferido para aislar el plásmido. En primer lugar, transformar 50 microlitros de las células competentes con un microlitro de plásmido que lleva el KanR de tipo salvaje.
Transformar un segundo conjunto de las células competentes con el plásmido que contiene KanR RC 29 con todos los codones de leucina reemplazados por el raro codón CTA. Placa e incubar el cultivo celular como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera las colonias que albergan el gen marcador de selección de tipo salvaje en el derivado rico en codón raro individualmente en cinco mililitros de medio LB diluido cinco veces que contiene kanamicina a una concentración de 50 microgramos por mililitro.
Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados mientras se agita a 250 rpm. Luego, transfiera 200 microlitros de cada uno de los cultivos celulares a una placa de 96 pozos en triplicado en puntos de tiempo definidos. Utilice un lector de placas para medir el OD600.
Inocular las manchas que albergan el gen marcador KanR RC 29 en dos conjuntos de cinco mililitros del medio de 0,2 x LB que contiene kanamicina, con o sin suministro de L-leucina. Añadir L-leucina a uno de los medios a una concentración final de un gramo por litro. Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados celsius con agitación a 250 rpm y medir el OD600 para cada cultivo en puntos de tiempo definidos.
Para empezar, transformar 50 microlitros de la cepa principal utilizada para la mutagénesis con un microlitro de plásmido que lleva el tipo salvaje GFP o el PPG de tipo salvaje. Placa e incubar los cultivos celulares como se describe en el protocolo de texto. A continuación, transfiera las colonias individualmente a cinco mililitros del medio LB correctamente diluido.
Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados con agitación a 250 rpm. Para marcadores de fluorescencia, transfiera 200 microlitros de los cultivos celulares a una placa posterior inferior de 96 bien clara en triplicado en puntos de tiempo definidos. Mida el OD600 en la fluorescencia y calcule la intensidad de la fluorescencia.
Para los marcadores cromogénicos, mida el desarrollo del color de los cultivos celulares. Realice el ensayo de alimentación como se describió anteriormente y mida la intensidad de fluorescencia o el desarrollo del color en puntos de tiempo definidos. En primer lugar, transformar 50 microlitros de las células mutantes con un microlitro del plásmido que lleva el marcador de selección KanR RC 29, o los marcadores de cribado GFP RC o PPG RC. A continuación, centrifugar los cultivos celulares a 4000 veces G durante cinco minutos.
Para la selección, deseche el sobrenadante y agregue cinco mililitros de 0,2 x medio LB que contengan kanamicina a las celdas que llevan el marcador de selección. Incubar la muestra durante la noche en una coctelera a 37 grados centígrados. Al día siguiente, plato el cultivo durante la noche en 0.2 x LB medio de agar que contiene kanamicina e incubar a 37 grados Celsius durante 12 horas.
Para el cribado, plate el número adecuado de células que albergan el marcador de cribado en el medio de agar LB que contiene el antibiótico adecuado. Incubar a 37 grados centígrados durante ocho horas. Después de esto, inocular el medio LB que contiene el antibiótico apropiado con cada colonia de la placa.
Incubar las muestras en una coctelera a 37 grados centígrados mientras se agita a 250 rpm. Mida el OD600 y la fluorescencia y calcule la intensidad de fluorescencia si se utiliza GFP RC. Mida el desarrollo del color de los cultivos celulares si se utiliza PPG RC.
Para verificar las productividades de aminoácidos de las cepas candidatas, preparar el cultivo de semillas inoculando cinco mililitros de medio LB con cada una de las cepas candidatas y dejar que las células crezcan durante la noche en un agitador a 250 rpm y a 37 grados celsius. Al día siguiente, cosecha las células de un mililitro del cultivo celular centrifugando a 4000 veces G durante dos minutos. Deseche el sobrenadante y resuspender la paleta con un mililitro de agua estéril.
Inocular 20 mililitros de medio M9 que contienen un cuatro por ciento de glucosa con 200 microlitros de la suspensión celular e incubar en un agitador de 250 mililitros a 250 rpm y a 37 grados centígrados durante 24 horas. Al día siguiente, centrifugar un mililitro del medio de cultivo a 4000 veces G durante cinco minutos. Transfiera 200 microlitros del sobrenadante a un tubo limpio de 1,5 mililitros.
Preparar soluciones estándar de L-leucina en las concentraciones mostradas aquí. En una campana de humo, agregue 100 microlitros de un trietilamina mililar y 100 microlitros de un isotiocianato de fenilo molar tanto al sobrenadante como a las normas. Mezclar las soluciones suavemente e incubarlas a temperatura ambiente durante una hora.
A continuación, añadir 400 microlitros de n-hexano al mismo tubo y vórtice durante diez segundos. La fase inferior contiene los derivados de aminoácidos y se utiliza para el análisis de HPLC. Filtrar la fase inferior a través de 0,2 membranas de politetrafluoroetileno microlitros.
Después de esto, ejecute un microlitro de la muestra en un ultra HPLC equipado con una columna C18 con un caudal de 0,42 mililitros por minuto y a temperatura de columna para 40 grados centígrados. Utilice un detector de matriz de diodos para detectar los aminoácidos objetivo a 254 nanómetros y calcular sus concentraciones mapeando las áreas de pico debajo de la curva estándar. En este estudio, los sobreproductores de aminoácidos se identifican mediante el uso de marcadores raros ricos en codón para lograr simultáneamente precisión, sensibilidad y alto rendimiento.
Para el sistema de selección, se debe observar una fuerte disminución de OD600 para las cepas que albergan el raro gen de resistencia a los antibióticos rico en codón en comparación con la cepa que alberga el tipo salvaje. La inhibición del codón raro en las expresiones proteicas se lleva a cabo principalmente en condiciones de hambre. Después de la alimentación adicional del aminoácido correspondiente, el OD600 para la cepa que alberga el raro gen de resistencia a los antibióticos rico en codón aumenta significativamente.
Para el sistema de cribado, la intensidad de la fluorescencia en el número de células fluorescentes es significativamente menor para la cepa que expresa la proteína fluorescente del gen rico en codón raro que del gen de tipo salvaje. La alimentación del aminoácido correspondiente restaurará las expresiones proteicas de los raros genes ricos en codón. Cuando se utiliza la proteína púrpura, el color desarrollado a partir del RARO PPG rico en codón es más ligero que el del gen de tipo salvaje.
El medio LB sin diluir permite la expresión lenta del PPG raro rico en codón sin alimentación de L-leucina en la proteína púrpura expresada se hace visible una vez que las células se peleen. Sin embargo, esto no oculta el hecho de que la expresión génica del rara PPG rica en codón se mejora mediante la alimentación de la L-leucina. La rara estrategia basada en codón podría identificar los sobreproductores de los aminoácidos dirigidos de la biblioteca de mutaciones y estos mutantes deben producir cantidades más altas de los aminoácidos dirigidos que las cepas madre.
Al intentar este procedimiento, es importante ajustar la frecuencia rara del codón para lograr una clara discriminación en el OD o color entre las células que albergan los marcadores de tipo salvaje y los derivados raros ricos en codón. El análisis de transcriptoma y la secuenciación del genoma podrían aplicarse a las cepas seleccionadas para investigar el mecanismo relacionado con las producciones de aminoácidos. Usando esta técnica, los sobreproductores de aminoácidos podrían ser identificados eficientemente y el análisis de su información genética ofrecería nuevas perspectivas sobre sus mecanismos detrás de las sobreproducciones de aminoácidos.
La derivación de aminoácidos podría ser perjudicial. Asegúrese de usar guantes y la ropa protectora y realice estos pasos en una campana de humos.
