Los protocolos Hi-C del núcleo permiten la exploración de la confirmación cromosómica a diferente resolución para la caracterización de bucles de cromatina, dominios y compartimentos que organizan el genoma. Este protocolo proporciona perfiles de alta resolución de interacciones genómicas a diferentes escalas, lo que produce una cobertura más consistente en toda la gama de distancias genómicas y datos con menos ruido técnico. La combinación de este protocolo con la edición genética es una estrategia poderosa para probar la función estructural de los elementos genéticos.
También se puede aplicar a la caracterización de variaciones estructurales que conducen a la enfermedad. El protocolo Hi-C del núcleo se puede aplicar para explorar la organización del genoma de cualquier genoma eucariota. Hacer el tratamiento SDS y Triton desagrega cualquier grupo nuclear por pipeteo, ya que los agregados interfieren con la eficiencia de la reacción enzimática, y asegúrese de realizar la medición de control de calidad adecuada antes de la secuenciación.
Comience agregando formaldehído sin metanol a una vez 10 a las siete células Drosophila De la Línea 2 Plus de Schneider en 17.5 mililitros de medio Schneider complementado con 10% FBS a una concentración final de 2%Incubar las células durante 10 minutos a temperatura ambiente con la mezcla cada 60 segundos o en una rueda giratoria, y agregar glicina a una concentración final de 0.125 molares con la mezcla. Después de cinco minutos a temperatura ambiente y 15 minutos en hielo, recoja las células por centrifugación y resuspuelva cuidadosamente el pellet en 25 mililitros de PBS frío y recoja las células con otra centrifugación. Al final de la centrifugación, vuelva a colocar las células en un mililitro de tampón de lisis helado para contar y ajuste las células a una concentración de una vez 10 a las seis celdas por mililitro.
Incubar las células en hielo durante 30 minutos, invirtiendo el tubo cada dos minutos para mezclar y recoger las células con otra centrifugación. Vuelva a colocar el pellet en un mililitro de tampón de lisis helado fresco. Después de la centrifugación, lave el lisato con un mililitro de tampón de restricción 1.25X.
Centrifuga de nuevo para recoger el lisato. Resuspend el pellet en 360 microlitros de tampón de restricción fresco y 11 microlitros de 10% SDS con pipeteo cuidadoso e incubar durante 45 minutos a 37 grados Centígrados y 7 a 950 revoluciones por minuto con pipeteo ocasional. Al final de la incubación, detenga la permeabilización con 75 microlitros de surfactante no iónico y devuelva el tubo a la incubadora durante 45 minutos adicionales con agitación a 950 revoluciones por minuto con pipeteo ocasional.
Para la digestión de la cromatina, agregue 200 unidades de Mbo1 al tubo para una incubación de cuatro a 16 horas a 37 grados Celsius con rotación. Al final de la incubación, inactivar la enzima con una incubación de 20 minutos a 60 grados centígrados. Para rellenar los voladizos de fragmentos de restricción y etiquetar los extremos de ADN con biotina, agregue 1,5 microlitros cada uno de 10 milimolares dCTP, dGTP, dTTP, 20 microlitros de 0,4 milimolares de biotina dATP, 17,5 microlitros de tampón tris bajo EDTA y 10 microlitros de cinco unidades por microlitro de ADN polimerasa un fragmento grande al tubo con una mezcla cuidadosa.
Incubar la reacción durante 75 minutos a 37 grados centígrados con agitación a 700 revoluciones por minuto cada 10 segundos durante 30 segundos. Al final de la incubación, agregue la mezcla de ligadura a la cromatina y ajústela a un volumen de reacción final de mililitros con una mezcla suave y completa e incube durante la noche a 16 grados centígrados. Para degradar las proteínas de la muestra, agregue 50 microlitros de 10 miligramos por mililitro de proteinasa K al tubo para una incubación de dos horas a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, aumente la temperatura a 65 grados centígrados durante la noche para revertir la reticulación de la muestra. A la mañana siguiente, degradar el ARN con 10 microlitros de 10 miligramos por mililitro RNAse A.Después de una hora a 37 grados centígrados, añadir un volumen de cloroformo fenol al tubo y mezclar bien por inversión para obtener una fase blanca homogénea. Después de precipitar el ADN de acuerdo con los protocolos estándar, cuantifique el ADN utilizando un colorante fluorogénico que se une selectivamente al ADN y un fluorómetro de acuerdo con las instrucciones del fabricante.
Para purificar el ADN de alícuotas no digeridas y digeridas, cargue 100 nanogramos de muestras no digeridas, digeridas y ligadas en un gel de agarosa al 1,5% y busque un frotis centrado en alrededor de 500 pares de bases en la muestra digerida frente a una banda de alto peso molecular para la muestra ligada. Para verificar el marcado Hi-C y la eficiencia de la ligadura mediante la amplificación y digestión de una interacción conocida, después de la PCR, digiera los productos con Mbo1, Cla1 o ambos, y ejecute las muestras en un nuevo gel de 1.5 a 2% para permitir la estimación del número relativo de uniones de ligadura 3C y Hi-C. Después de sonicar la muestra para obtener de 200 a 500 fragmentos de ADN de pares de bases, transfiera 130 microlitros con cinco microgramos de ADN de cada muestra a nuevos tubos de microcentrífuga que contienen 16 microlitros de tampón de ligadura 10X, dos microlitros de dATP milimolar, cinco microlitros de ADN polimerasa T4 y siete microlitros de agua destilada doble para una incubación de 30 minutos a 20 grados centígrados.
Al final de la incubación, agregue cinco microlitros de 10 dNTP milimolares, cuatro microlitros de tampón de ligadura 10X, cinco microlitros de polinucleótido quinasa T4, un microlitro de ADN polimerasa, un fragmento grande y 25 microlitros de agua destilada doble a los tubos para una segunda incubación de 30 minutos a 20 grados centígrados. Para seleccionar fragmentos principalmente en el rango de tamaño de par de bases de 250 a 550, realice una selección secuencial de fase sólida reversible y de tamaño de movilización con 0.6X, luego 0.9X de acuerdo con las instrucciones del fabricante y elute el ADN con 100 microlitros de tris bajo EDTA. Para el desplegable de biotina para cada biblioteca, lave 150 microlitros de perlas magnéticas unidas a la estreptavidina dos veces con 400 microlitros de tampón 1X Tween y gire las muestras durante tres minutos en una rueda giratoria.
Al final de la incubación, vuelva a colocar las perlas en 300 microlitros de 2X sin tampón Tween y mezcle con 300 microlitros de material Hi-C para una rotación de 30 minutos en una rueda giratoria. Al final de la incubación, lave las perlas con 400 microlitros de tampón Tween 0.5X para una incubación de tres minutos a 55 grados Celsius y 750 revoluciones por minuto, seguido de dos lavados en 200 microlitros de tampón de restricción 1X por lavado. Después del segundo lavado, vuelva a colocar las perlas en 100 microlitros de mezcla de cola dATP para una incubación de 30 minutos a 37 grados centígrados.
Al final de la incubación, vuelva a colocar las perlas en 50 microlitros de tampón de ligadura 1X y transfiera la suspensión a un nuevo tubo que contenga cuatro adaptadores finales pareados pre-recocidos y dos microlitros de ligasa T4. Después de dos horas a temperatura ambiente, retire el sobrenadante y lave las perlas dos veces con 400 microlitros de tampón Tween, luego lave las cuentas una vez con 200 microlitros sin tampón Tween y una vez con 100 microlitros de tampón de restricción antes de volver a suspender las cuentas en 40 microlitros de tampón de restricción 1X. Se observa un frotis de 200 a 1, 000 pares de bases cuando la restricción con Mbo1 es exitosa.
Si la ligadura es exitosa, se observa una banda de alto peso molecular en la parte superior del gel. La eficiencia de la digestión también se puede confirmar mediante PCR cuantitativa. Una eficiencia de digestión aceptable es del 80% o superior.
Como se ilustra, la amplificación de una interacción de rango medio conocida en productos de ligadura Hi-C se puede estimar mediante la digestión del producto de PCR recuperado en la amplificación. Se recomienda una eficiencia de digestión de más del 70% para evitar tener una gran proporción de lecturas no útiles para las bibliotecas después de la secuenciación. El número de ciclos de PCR para la amplificación final debe ser un ciclo menor que el número de ciclos para los que el frotis es visible.
El nivel de digestión de la biblioteca indica la abundancia de pares Hi-C válidos y refleja la proporción de lecturas útiles que se obtendrán de la biblioteca. Utilizando los pares Hi-C válidos únicos, se puede realizar un análisis básico de la distribución de pares. Como se observa en este ejemplo representativo, el locus del gen NOTCH se puede ver junto con las proteínas arquitectónicas, los dominios uno y dos, y las modificaciones de histonas a lo largo del locus.
Tras la eliminación de la región que contiene los sitios de unión al ADN CTCF y M1BP, se puede observar un cambio dramático en los contactos de cromatina. Después del experimento Hi-C, se puede realizar un para llegar a un conjunto específico de contactos, por ejemplo, de las regiones promotoras. Esto es particularmente útil cuando se evalúan genomas grandes.
Como se ha demostrado, la combinación del protocolo Hi-C con la adición genética se puede utilizar para evaluar la función estructural y reguladora de los elementos genómicos.
