Esta técnica permite observar largos procesos biológicos en cámaras de óvulos de Drosophila diseccionadas, como la migración nuclear de ovocitos, utilizando microscopía de imágenes en vivo. Este protocolo describe cómo mantener vivas las cámaras de óvulos disecadas durante 12 horas para realizar microscopía de imágenes en vivo. Para empezar, pipetea 200 microlitros de Schneider Medium y complementa con 30 microlitros de 10 miligramos por mililitro de insulina, luego agrega cuatro microlitros de suero de ternero fetal inactivado por calor.
Use una punta de pipeta para aplicar una pequeña cantidad de grasa de silicona alrededor del orificio en la parte inferior de la diapositiva perforada. Coloque un coverslip y use el extremo ancho de la punta de una pipeta para aplicar presión sobre el coverslip para aplanar la grasa de silicona para crear un anillo de silicona en el interior de la diapositiva. Transfiera las moscas hembra anestesiadas al pozo de disección que contiene 150 microlitros del medio de imagen.
Para diseccionar a la hembra, use las pinzas para agarrar el tórax y pellizcar la cutícula dorsal del abdomen con un segundo par de fórceps. Retire cuidadosamente el útero, el oviducto y la hera muscular. Aísle y separe el par de ovarios visibles en la abertura de la cutícula.
Coloque una gota de 10 a 15 microlitros del medio de imágenes en los ovarios y transfiera un ovario a la cámara de imágenes. Para separar los ovarioles, use la aguja para sostener el extremo posterior del ovario. Use otra aguja para tirar cuidadosamente del germario para separar los ovarioles.
Sostenga la hela con una aguja y tire del ovariole a través de las cámaras más grandes con otra aguja para eliminar la hela muscular restante en las cámaras de huevos. Permita que el ovariole desenvainado se hunda y entre en contacto con la cubierta. Retire las últimas etapas y el resto de los ovarios de la microcámara con pórceps.
Use agujas para distanciar cuidadosamente los ovarioles para facilitar la adquisición. Cortar un pequeño cuadrado de 10 por 10 milímetros de la membrana permeable. Aplique cuidadosamente la membrana en la parte superior del medio de imagen para expulsar cualquier burbuja de aire.
Luego selle herméticamente la cámara con una capa delgada de aceite de halocarbono alrededor del pozo en el contorno de la membrana. Coloque la configuración de imágenes en el soporte deslizante del microscopio invertido y use un objetivo 40X. La migración del núcleo de ovocitos de una cámara de óvulos de tipo silvestre se capturó mediante microscopía de imágenes en vivo.
El núcleo alcanza la membrana plasmática anterior o la membrana plasmática lateral antes de deslizarse a lo largo de las trayectorias para alcanzar su posición final en la intersección de las dos membranas plasmáticas. Las deformidades de la membrana, las células foliculares desorganizadas, las células atrofiadas y los núcleos encogidos son los primeros signos de cámaras de óvulos moribundas. El ovocito degenerado antes de las ocho horas de la imagen generalmente no se detecta.
Sin embargo, los casos raros de degeneración temprana se deben a problemas durante la disección o los pasos de montaje. Dañar las cámaras de huevos compromete su supervivencia. Por lo tanto, la delicada disección precisa a mano y la preparación de la microcámara son primordiales.
Este procedimiento nos permitió visualizar que el núcleo del ovocito puede tomar tres trayectorias diferentes durante su migración y diferentes orgánulos regulan estas trayectorias dentro del ovocito.
