Damos las gracias a Janice Fischer para proporcionar el plásmido UAS-EGFP :: Msp-300 KASH. El anticuerpo mAB24B10 se obtuvo del Estudios del Desarrollo del Banco hibridoma desarrollado bajo los auspicios del NICHD y mantenido por la Universidad de Iowa, Departamento de Biología. El stock de repo-GAL4 (BL7415) se obtuvo del Stock Center Bloomington en Indiana University. El apoyo de la Sociedad Americana del Cáncer Institucional Investigación Grant (IRG # 58-006-53) al Centro de la Universidad de Purdue para la Investigación del Cáncer se agradece. Jingqun Ma se apoya en una Investigación Agrícola de Purdue ayudantía en la Agricultura y la Alimentación de la Universidad de Purdue.

1. Generación y caracterización de EGFP :: KASH de Drosophila <ol><li> Controlador Cruz Gal4 vuela a UAS-EGFP :: Msp-300 KASH vuela. Alternativamente, moscas recombinantes que llevan tanto el conductor de Gal4 y el transgén UAS-EGFP :: MSP-300 KASH se pueden generar usando técnicas genéticas estándar. Este segundo enfoque es ventajoso si se requieren un gran número de progenie. </li><li> Caracterizar la expresión del marcador EGFP :: KASH usando técnicas de microscopía estándar. Nota: EGFP expresión se puede observar mediante técnicas de microscopía estándar en los tejidos de Drosophila disecadas, fijas o en larvas de conjunto, y no requiere el uso de un anticuerpo. <ol><li> Determinar el patrón de expresión de la EGFP :: KASH marcador en todo el organismo bajo un microscopio de fluorescencia de disección (véase Materiales PDF). Nota: Muchos conductores Gal4, incluido el conductor repo-GAL4 se muestra en la Figura 1, Anexo Npatrones onspecific de expresión en otros tejidos larvarios, como las glándulas salivales (ver resultados). </li><li> Analizar el patrón de expresión de EGFP :: KASH en el tejido diseccionado de interés utilizando microscopía confocal. <ol><li> Fijar el tejido de interés el uso de formaldehído a una concentración final de 4%, y ADN de manchas usando DAPI a una concentración final de 0,1 mg / ml para visualizar la localización de la EGFP :: KASH etiqueta con respecto a ADN. </li><li> Adquirir imágenes usando ya sea un objetivo de 40X / 1,30 aceite de inmersión o un objetivo de 20x / 0,75 de inmersión en aceite, dependiendo del tamaño del tejido de interés. Las siguientes condiciones de excitación / emisión pueden ser utilizados para la adquisición de imágenes: 408 nm/425-475 nm (DAPI); 488 nm / 525-550 nm (GFP). </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Aislar Núcleos de Drosophila larvas tejidos <ol><li> Prepare el equipo para la disección de tejidos de las larvas y el posterior aislamiento de núcleos. Tenga en cuenta quedechorionated embriones enteros también podrían ser utilizados como material de partida, si se desea. Se recomienda el uso de tejidos de larvas parcialmente disecados en lugar de larvas todo si el tipo de célula de interés está presente en un tejido específico tal como el disco imaginal. Esto reduce la unión no específica, y también elimina los problemas que pueden ser causados ​​por la expresión de algunos controladores de Gal4 en células no diana. <ol><li> Prepare dos pares de pinzas cortantes (ver Materiales PDF), una placa de vidrio 9-así siliconado (ver Materiales PDF), y PBT (PBS 1x, pH 7,4; 0,1% de Tween-20). </li><li> Prebind la GFP de anticuerpos a las perlas magnéticas. Este paso se debe iniciar antes de comenzar la disección. Añadir 10 l de las perlas magnéticas (Invitrogen, ver Materiales PDF) y 2 g de GFP de anticuerpos (Roche, ver Materiales PDF) a 400 l de tampón de lavado (PBS 1x, pH 7,4; 2,5 mM de MgCl 2) en un tubo de 1,5 ml . La cantidad de perlas y anticuerpo utilizado se puede optimizar si es necesario sobre la base de la cantidad de diana en el Samplo y la afinidad de unión del anticuerpo a las perlas. </li><li> Incubar las perlas y el anticuerpo con rotación durante al menos 30 min a temperatura ambiente. </li><li> Colocar el tubo de 1,5 ml que contiene las perlas y el anticuerpo en la gradilla magnética (ver Materiales PDF) y permiten que las perlas se unan a la magnética durante aproximadamente 1-2 minutos. Eliminar el sobrenadante que contiene el anticuerpo no unido y tampón de lavado utilizando una pipeta de 1 ml. Las cuentas se mantendrán atados a la pared del tubo de 1,5 ml en el lado adyacente al imán. </li><li> Enjuague las perlas dos veces con 1 ml de tampón de lavado cada vez que se describe en la sección 2.1.4. Retire el tubo de 1,5 ml de la rejilla magnética y se invierte brevemente para mezclar los granos y tampón de lavado en cada paso de lavado. </li><li> Guarde las perlas de anticuerpo unido en tampón de lavado hasta que esté listo para continuar con el paso 2.7. Las perlas no se debe permitir que se seque en cualquier etapa del protocolo. </li></ol></li><li> Diseccionar los tejidos larvarios en la valoración PBT y transferir los tejidos disecados aun pocillo de la placa de 9 hoyos. Por lo general, la disección del lóbulo óptico y el ojo disco imaginal de 100 larvas de tercer instar proporciona material suficiente para el análisis de la expresión génica aguas abajo después del aislamiento de núcleos. </li><li> Enjuague el tejido aislado en tampón de extracción nuclear (10 mM de HEPES-KOH, pH 7,5; 2,5 mM de MgCl 2; KCl 10 mM) en un tubo de 1,5 ml. Transferir los tejidos aislados de larvas a un 1 ml de homogeneizador Dounce (ver Materiales PDF) en hielo que contiene 1 ml de tampón de extracción nuclear fresco. Incubar en hielo durante 5 min. No es necesario añadir inhibidores de la proteasa si es ARN que ser extraído después del aislamiento núcleos. </li><li> Interrumpir el tejido por 20 golpes con la mano del mortero suelto y luego incubar la muestra en hielo durante 10 min para permitir que las células se hinchen. Extracto de los núcleos de las células usando 15 golpes con la mano del mortero apretado. El número de golpes con las manos de mortero flojo y apretado debe ser optimizado para diferentes tejidos y tipos de células; exceso de homogeneización puede resultar ennúcleos esquilada, mientras homogeneización insuficiente no extraerá todos los núcleos de los tejidos. </li><li> Filtrar el homogenato, que contiene los núcleos y restos celulares, a través de un filtro de tamaño de poro de 40 micras (ver Materiales PDF) que ha sido prerinsed con tampón de homogeneización nuclear. Recoger el homogeneizado filtrado en un tubo nuevo. </li><li> Recoger muestras de pre-aislamiento para el análisis posterior para determinar el rendimiento núcleos, la integridad de los núcleos, y para determinar los niveles de transcripción de genes diana anteriores a los núcleos de aislamiento. <ol><li> Transferencia de 50 l de la homogeneizado filtrado a un tubo de 1,5 ml fresco con una pipeta. Esta es la muestra de pre-aislamiento. Añadir 500 l de reactivo Trizol (ver PDF Materiales, PRECAUCIÓN), invertir para mezclar y almacenar a -20 ° C para el aislamiento de ARN posterior (paso 3.1). </li><li> Transferencia de 20 l de la homogeneizado filtrado a un tubo nuevo 1,5 ml. <ol><li> Añadir DAPI a una concentración final de 0,1 g / ml, y IncUbate muestra en hielo durante 10 min. </li><li> Traslado núcleos teñidos con DAPI a un cubreobjetos recubiertos de poli-lisina, y colocar en un portaobjetos de microscopio. Sellar el cubreobjetos utilizando el esmalte de uñas transparente. </li><li> Compruebe la integridad núcleos, y la presencia de núcleos de GFP-etiquetados de interés utilizando microscopio de fluorescencia. Nota: No es necesario fijar los núcleos, o para teñir de GFP si estas diapositivas se analizan razonablemente rápido después de la preparación (a menos de 24 horas). </li></ol></li><li> Transferencia de 10 l de la homogeneizado filtrado a un tubo nuevo 1,5 ml y añadir 90 l de tampón de lavado (PBS 1x, pH 7,4; 2,5 mM de MgCl 2). Añadir DAPI a una concentración final de 0,1 g / ml, y se incuba en hielo durante 10 min. Determinar el rendimiento núcleos en la muestra pre-aislamiento usando un hemocitómetro para contar los núcleos con DAPI positiva utilizando epifluorescencia bajo un objetivo de aire 10 veces. </li></ol></li><li> Coloque el tubo de 1,5 ml que contiene las perlas de anticuerpo unido (preparadas en la sección 2.1.6) en un bastidor magnético,y permitir que las perlas magnéticas se unan al imán durante al menos 2 minutos como se describe en la sección 2.1.4. Retirar el tampón de lavado de las perlas de anticuerpo unido utilizando una pipeta de 1 ml, y añadir el homogeneizado filtrado desde el paso 2.5 al tubo de 1.5 ml con una pipeta de 1 ml. </li><li> Invertir suavemente el tubo varias veces para mezclar, y se incuba a 4 ° C durante 30 min con el extremo de extremo a agitación. Evitar burbujas en el tubo, si es posible ya que éstos pueden resultar en la formación de grumos de los núcleos. </li><li> Coloque el tubo de 1,5 ml que contiene las perlas de anticuerpo unido y homogeneizado en un estante magnético, y permitir que las perlas magnéticas se unan al imán durante al menos 2 minutos como se describe en la sección 2.1.4. Retire el homogeneizado que contiene la fracción de núcleos no unido usando una pipeta de 1 ml. </li><li> Lavar la muestra 3x con 1 ml de tampón de lavado en cada ocasión. Retire el tubo de 1,5 ml que contiene los granos, los núcleos unidos y tampón de lavado del bastidor e invierta para mezclar varias veces, y luego colocar el tubo en el soporte magnético como se describeen el paso 2.9 y eliminar el sobrenadante utilizando una pipeta de 1 ml. </li><li> Añadir 150 l de tampón de lavado a las perlas, que deben ser enlazados a los núcleos blanco. Esta es la muestra post-aislamiento. Preparar las muestras para el análisis de microscopía y posterior extracción de RNA. <ol><li> Transferencia de 20 l de la muestra después de la aislamiento a un tubo de 1,5 ml fresco y tinción con DAPI y analizar como se describe en el apartado 2.6.2. Contar el GFP + / DAPI + y + GFP-/DAPI núcleos capturados por perlas magnéticas para determinar la pureza de la GFP enriquecido + núcleos en la muestra de post-aislamiento. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo Trizol al resto de la muestra después de la aislamiento, invierta para mezclar y almacenar a -20 ° C para el aislamiento de ARN posterior (paso 3.1). Nota: Las muestras en Trizol se pueden almacenar durante varias semanas si es necesario a -20 º C. No es necesario para eluir los núcleos de las perlas magnéticas antes de la extracción de ARN usando reactivo Trizol, pues dee las perlas no interfieran con el aislamiento de ARN posterior. </li></ol></li></ol> 3. Determinar niveles de transcripción en núcleos aislados de larvas tejidos <ol><li> Aislar el ARN de las muestras de pre-y post-de aislamiento de aislamiento preparados en las secciones 2.6.1 y 2.11.2 utilizando el protocolo estándar descrito para la extracción de ARN a base de Trizol (ver Materiales PDF) con las siguientes modificaciones: <ol><li> Después de la precipitación del sedimento de RNA, añadir 19,2 l de agua libre de RNasa y 0,8 l de reactivo RNASecure (ver Materiales PDF) al sedimento y se incuba a 60 ° C durante 20 minutos para inactivar RNAsas. </li></ol></li><li> Determinar la concentración de ARN con un colorante fluorescente de unión a ARN tales como el kit de ensayo de ARN Qubit (ver Materiales PDF) usando el fluorómetro 2,0 QubitR siguiendo el protocolo del fabricante. </li><li> Sintetizar cDNA utilizando una transcriptasa inversa tal como la amplificación de la EpiScript kit de transcriptasa inversa y cebadores oligodT siguiendo las instrucciones del fabricante. Nota: Típicamente, 50 a 100 ng de ARN genera suficiente ADNc para llevar a cabo los análisis de la expresión de múltiples genes. Cantidades equivalentes de pre-ARN aislamiento y de post-aislamiento se deben utilizar para generar ADNc. </li><li> Añadir 180 l de agua libre de nucleasa a la muestra de cDNA 20 l para diluir este antes de la PCR en tiempo real cuantitativa (qPCR) el análisis de 10 veces. Esta dilución es un paso importante, ya que las muestras de cDNA sin diluir pueden inhibir la qPCR. </li><li> Preparar una mezcla maestra de qPCR con polimerasa y dNTPs, 4 pmoles de cada uno de adelante y cebador inverso, compuesto con agua estéril para que el volumen final de reacción de 20 l. <ol><li> Diseñar cebadores de qPCR a sus genes diana que se espera que se exprese en el tipo celular de interés, y en la etapa de desarrollo en la que se recoge el tejido. Diseño de cebadores abarcar un intrón, si es posible, de manera que genómico yproductos de PCR de ADNc se pueden distinguir. Nota: Si no se conoce el perfil de expresión de genes del tipo de célula diana, cebadores contra eGFP, que debe ser expresada específicamente en la población de núcleos marcados, se pueden usar para optimizar el protocolo para un tipo de célula particular y el tejido (Tabla 1). </li></ol></li><li> Determinar los niveles de transcripción relativos de cada gen de interés en las muestras de pre-y post-de aislamiento de aislamiento por comparación con una serie de dilución de ADNc preparada a partir de todo el tejido. Los niveles de transcripción de los genes diana deberían normalizarse a un gen de referencia, como RPL32 (o preferiblemente varios genes de referencia). </li></ol>

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Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo se puede utilizar para aislar o enriquecer altamente específicamente etiquetados núcleos de poblaciones de células mixtas en embriones de Drosophila o tejidos de larvas. Usando este protocolo, los núcleos se pueden aislar a partir de tejidos disecados en aproximadamente 1 hora. La pureza y el rendimiento de los núcleos aislados deben determinarse experimentalmente para cada tipo de célula. Puede ser difícil de cuantificar los núcleos de talón unida en la etapa de post-aislamiento del pro...

Tejidos de Drosophila tales como el sistema nervioso central contienen una mezcla compleja de tipos de células. Por lo tanto, para analizar los perfiles de expresión de genes específicos de células de tejidos de Drosophila, es primero necesario aislar una población homogénea de células específicas en cantidades suficientes para permitir que las aplicaciones posteriores. Métodos para aislar células de tejidos intactos incluyen microdisección por láser, y de células activadas por fluorescencia (FACS) de células enteras. Mientras FACS se ha utilizado para aislar las células y los núcleos de embriones de Drosophila y de Caenorhabditis elegans para la expresión génica y la cromatina de perfiles de 1-3, FACS y microdisección por láser puede ser difícil de realizar con éxito en los tejidos que contienen tipos de células altamente mezclados o que las células con contener morfología irregular, tales como neuronas. Para superar esta dificultad, los núcleos en lugar de las células se pueden aislar a partir de tipos de células específicos y se utilizan para la posterior generaciónde perfiles de expresión de correo. Es importante destacar que el análisis de la expresión de mRNA microarrays basado en el uso de muestras de ARN nucleares muestra resultados generalmente comparables con la realizada utilizando ARN total 4, 5. Por otra parte, el análisis de la expresión génica usando ARN nuclear ha sido utilizado con éxito para estudiar la expresión génica en varios organismos, incluyendo C. elegans, Arabidopsis thaliana, Drosophila, y los seres humanos 4, 5 2, 3. Varios enfoques han sido recientemente descrita para el aislamiento de poblaciones específicas de núcleos marcados de tejidos de Drosophila que son adecuados para el análisis de la expresión génica y / o la inmunoprecipitación de la cromatina. El aislamiento lote de cromatina específica de tejido para el método de inmunoprecipitación (BITS-CHIP) utiliza FACS para aislar los núcleos fijos sobre la base de la expresión específica de tipo celular de GFP-nuclear localizada 2. Este enfoque ha sido doccessfully utilizado para analizar la distribución de las modificaciones de histonas y los factores de transcripción de la cromatina utilizando inmunoprecipitación de núcleos aislados a partir del mesodermo de Drosophila embriones 2. Sin embargo, los enfoques basados ​​en FACS pueden ser menos adecuado para el aislamiento de núcleos marcados que constituyen sólo una pequeña proporción de una población mixta debido al aumento del tiempo de tipo necesario para obtener números adecuados para aplicaciones posteriores. Para superar estas limitaciones, varios grupos han utilizado técnicas de aislamiento basados ​​en afinidad para purificar los núcleos que están etiquetados con un epítopo específico de un tipo de célula particular. El aislamiento de los núcleos marcados en tipos de células específicos de método (INTACTO) desarrollados para su uso en Arabidopsis thaliana 6, 7 ha sido recientemente adaptado para su uso en Drosophila 8. En este método, una proteína de fusión envoltura nuclear que es un sustrato para la biotinilación en vivo es coexpressed con la Escherichia coli biotina ligasa BirA en tipos celulares específicos. Núcleos marcados con biotina pueden ser posteriormente purificados a partir de poblaciones mixtas que utilizan el aislamiento de afinidad basada-estreptavidina. El uso de este enfoque, los núcleos fueron etiquetados con éxito y aislados del mesodermo de embriones de Drosophila en la que una proteína de fusión envoltura nuclear se expresó bajo el control de un promotor-mesodermo específica 8. Los autores también generaron proteínas de fusión de la envoltura nuclear que se pueden expresar en cualquier tipo de célula bajo el control de la secuencia reguladora de Gal4, UAS 9. Este enfoque es capaz de subconjuntos de núcleos marcados de poblaciones mixtas aislar rápidamente, pero requiere tres construcciones transgénicas independientes y por lo tanto puede ser inadecuado para aplicaciones particulares genéticos. Recientemente, un enfoque ha sido descrito en el que dom (S AD1 y de la ONU C-84), las proteínas que contienen el dominio que se localizan en la membrana interna de la envoltura nuclear fueron etiquetados conproteínas fluorescentes y expresado bajo el control del sistema de Gal4/UAS 10. Los núcleos se aislaron en presencia de detergente no iónico para eliminar la membrana externa de la envoltura nuclear, y se purificó por afinidad usando perlas magnéticas acopladas a anticuerpos anti-GFP. Este enfoque ha sido utilizado con éxito para aislar las poblaciones pequeñas de núcleos marcados de subtipos neuronales específicos en el cerebro adulto de Drosophila 10. Aquí, se describe un protocolo para el aislamiento de núcleos marcados de una población mixta de células de tejido de larvas de Drosophila. Este método fue desarrollado de forma independiente, pero es similar al enfoque descrito por Henry et al. 10 En primer lugar, los núcleos fueron marcadas con una etiqueta fluorescente que se expresa sólo en tipos de células específicos en Drosophila melanogaster para facilitar el posterior aislamiento de los núcleos etiquetados de poblaciones mixtas utilizando un enfoque basado en la afinidad. Para etiquetar núcleos,Se utilizó el dominio KASH (K larsicht / A nc-1 / S ino h omology). El dominio KASH es un dominio transmembrana que se localiza en la membrana externa de la envoltura nuclear, en parte a través de interacciones con proteínas que contienen el dominio dom dentro del espacio perinuclear 11. El dominio KASH C-terminal de las proteínas tales como Drosophila MSP-300 y Klarsicht ancla estas proteínas a la membrana nuclear externa, mientras que sus dominios N-terminal de interactuar con las proteínas del citoesqueleto, tales como actina o los microtúbulos en el citoplasma 12-14. Las construcciones se generaron en el que el dominio KASH de Drosophila MSP-300 se fusiona al C-terminal de EGFP, bajo el control de la secuencia reguladora de Gal4, UAS en el vector pUAST-attB 15, 16. Uso de integración específica de sitio phiC31, se generaron moscas transgénicas en las que los UAS-EGFP :: MSP-300 KASH transgén se inserta en los loci en el cromosoma attP23L 17. La UAS-EGFP :: MSP-300 KASH moscas pueden ser cruzado con moscas que expresan el controlador de Gal4 en un tipo de célula particular, que resulta en la expresión dirigida de EGFP en la membrana nuclear externa en el tipo celular de interés. Núcleos marcado puede entonces purificarse a partir de poblaciones de células mixtas usando anticuerpos frente a GFP acoplados a perlas magnéticas. En este enfoque, no se requiere el uso de detergente no iónico porque la etiqueta EGFP se localiza en el lado citoplásmico de la membrana nuclear externa, y por lo tanto es accesible a los anticuerpos. El protocolo descrito a continuación se puede utilizar para aislar / enriquecer núcleos EGFP marcado de tipos de células específicas en los tejidos de las larvas de Drosophila, para cuantificar la pureza y el rendimiento de núcleos aislados, y para extraer ARN nuclear adecuado para la transcripción inversa-reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (QRT -PCR), análisis de la expresión génica. El aislamiento y la purificación por afinidad de los núcleos (excluyendo tissue disección) se puede realizar en menos de una hora. Los resultados se presentan mostrando que los núcleos gliales se pueden aislar con éxito desde el lóbulo óptico de las larvas y el ojo disco imaginal, y se utilizaron para el análisis de la expresión génica posterior. Se prevé que este enfoque será útil para el aislamiento / enriquecimiento de núcleos marcados a partir de tejidos de embriones y larvas en el que las células diana constituyen menos del 5% de la población general. Todas las poblaciones de Drosophila y plásmidos generados en este estudio están disponibles a partir de los autores que lo soliciten.

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		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Anti-chaoptin antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td style="width:263px;">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td style="width:195px;">mAB24B10</td>
			<td style="width:828px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Anti-GFP antibody (mouse, monoclonal)</td>
			<td>Roche</td>
			<td>11814460001</td>
			<td>This specific antibody is recommended for this protocol. However, alternative antibodies could also be used.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">2X Bullseye EvaGreen qPCR Mastermix with ROX</td>
			<td>MidSci</td>
			<td>BEQPCR-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">DAPI (4&#39;,6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride salt)</td>
			<td>Biotium</td>
			<td>40011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dounce Homogenizer (1 ml)</td>
			<td>VWR</td>
			<td>62400-595</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dumont #5 Tweezers, 11 cm</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>14095</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dynabeads Protein G for Immunoprecipitation</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>10003D</td>
			<td>This specific brand of magnetic beads is recommended for this protocol.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">EpiScript Reverse Transcriptase</td>
			<td>Epicentre</td>
			<td>ERT12910K</td>
			<td><a href="http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf">http://www.epibio.com/docs/default-source/protocols/episcript-reverse-transcriptase.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Falcon cell strainers, 40 &#956;m pore size</td>
			<td>VWR</td>
			<td>21008-949</td>
			<td>Alternative pore sizes could be used, depending on the size of the target cell nuclei.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Magnetic stand (8 x 1.5 ml tubes)</td>
			<td>Millipore</td>
			<td>LSKMAGS08&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Mini tube rotator</td>
			<td style="width:263px;">Genemate</td>
			<td style="width:195px;">H-6700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:599px;">Qubit starter kit</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">Q32871</td>
			<td style="width:828px;">Similar fluorescence-based methods for quantifying RNA yield could be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdf">http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/mp32852.pdfZ</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RNAsecure (Ambion)</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:195px;">AM7010</td>
			<td style="width:828px;">The use of this reagent to inactivate RNAses is optional.</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">RT-PCR machine Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">CFX Connect Thermal Cycler</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Siliconized 9 well glass plate</td>
			<td>Hampton Research</td>
			<td>HR3-134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Stereomicroscope Fluorescence Adapter (Royal Blue (440 - 460nm) excitation + yellow barrier</td>
			<td style="width:263px;">Nightsea</td>
			<td style="width:195px;"></td>
			<td>This adaptor enables GFP fluorescence to be examined using a typical dissecting microscope (eg Nikon)</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">StereoZoom Microscope 83604 Set with 10X Wide Field Eyepieces and Universal Boom Stand</td>
			<td style="width:263px;">Nikon</td>
			<td style="width:195px;">SMZ 745</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:599px;">Thermal Cycler</td>
			<td style="width:263px;">BioRad</td>
			<td style="width:195px;">T100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Trizol reagent</td>
			<td style="width:263px;">Life Technologies</td>
			<td>15596018</td>
			<td>CAUTION; Alternative RNA extraction methods can be used. <a href="http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf" >http://tools.invitrogen.com/content/sfs/manuals/trizol_reagent.pdf</a></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Tween 20</td>
			<td>Amresco</td>
			<td>0777-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

affinity-based isolation of tagged nuclei from drosophila tissues for gene expression analysis

Tejidos de embriones y larvas de Drosophila melanogaster a menudo contienen una mezcla altamente heterogénea de tipos de células, lo que puede complicar el análisis de la expresión génica en estos tejidos. Por lo tanto, para analizar los perfiles de expresión de genes específicos de células de tejidos de Drosophila, puede ser necesario aislar los tipos de células específicas con alta pureza y con rendimientos suficientes para aplicaciones posteriores tales como el perfil transcripcional y de inmunoprecipitación de la cromatina. Sin embargo, la morfología celular irregular en tejidos tales como el sistema nervioso central, junto con la población rara de tipos específicos de células en estos tejidos, puede plantear problemas para los métodos tradicionales de aislamiento de células, tales como la microdisección láser y de células activadas por fluorescencia (FACS) . Aquí, un enfoque alternativo para la caracterización de los perfiles de expresión de genes específicos de células usando el aislamiento basado en la afinidad de los núcleos marcados, en lugar de células completas, se describe. Núcleos de la c específicaTipo de interés ell están etiquetados genéticamente con un sobre-localizada etiqueta EGFP nuclear utilizando el sistema de expresión binaria Gal4/UAS. Estos núcleos EGFP-etiquetados se pueden aislar utilizando anticuerpos contra la GFP que están acoplados a perlas magnéticas. El enfoque descrito en este protocolo permite el aislamiento consistente de los núcleos de tipos de células específicas en el sistema nervioso central de Drosophila larvas en alta pureza y en niveles suficientes para el análisis de expresión, incluso cuando estos tipos de células comprenden menos del 2% de la población total de células en el tejido. Este enfoque se puede utilizar para aislar los núcleos a partir de una amplia variedad de Drosophila embrionario y tipos de células de larvas utilizando controladores específicos Gal4, y puede ser útil para el aislamiento de núcleos de tipos de células que no son adecuados para FACS o microdisección por láser.

El conductor repo-GAL4 (Bloomington código RS 7415) se expresa específicamente en las células gliales en el sistema nervioso de Drosophila en múltiples etapas de desarrollo 18. Las moscas se generaron que expresa de manera estable UAS-EGFP :: MSP-300 KASH bajo el control del controlador de repo-GAL4 utilizando técnicas genéticas estándar. Para caracterizar el patrón de expresión de la EGFP :: KASH transgén en estas moscas, se examinó el patrón de expr...

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Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis | Biology | Video

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Tejidos de Drosophila a menudo contienen una mezcla heterogénea de tipos celulares. Para examinar la expresión génica en tipos de células específicas de un tejido particular, los núcleos pueden ser etiquetados genéticamente y aislados posteriormente utilizando un enfoque basado en la afinidad. Núcleos aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores tales como análisis de la expresión génica y la inmunoprecipitación de la cromatina.

Aislamiento a base de afinidad de Tagged Núcleos de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los tejidos para análisis de expresión génica

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

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14.6K vistas.  Purdue University.  Tejidos de Drosophila a menudo contienen una mezcla heterogénea de tipos celulares. Para examinar la expresión génica en tipos de células específicas de un tejido particular, los núcleos pueden ser etiquetados genéticamente y aislados posteriormente utilizando un enfoque basado en la afinidad. Núcleos aislados se pueden utilizar para aplicaciones posteriores tales como análisis de la expresión génica y la inmunoprecipitación de la cromatina. 

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Gen bacteriano y Análisis de Expresión El uso de microarrays

Investigación

Biología

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

La preparación de cultivos primarios de células hematopoyéticas de la médula ósea murina por electroporación

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

Aislamiento del ARN de síntesis embrionarias pez cebra y el cDNA de análisis de expresión génica

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

Utilizando el sistema de electroporación Gene Emisores MXcell para transfectar células primarias con alta eficiencia

Robotics and Dynamic Image Analysis for Studies of Gene Expression in Plant Tissues

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods presented here utilize the green fluorescent protein (gfp) gene for continual monitoring of gene expression in the same pieces of tissues, over time. The gfp gene was placed under regulatory control of different promoters and introduced into lima bean cotyledonary tissues via particle bombardment. Cotyledons were then placed on a robotic image collection system, which consisted of a fluorescence dissecting microscope with a digital camera and a 2-dimensional robotics platform custom-designed to allow secure attachment of culture dishes. Images were collected from cotyledonary tissues every hour for 100 hours to generate expression profiles for each promoter. Each collected series of 100 images was first subjected to manual image alignment using ImageReady to make certain that GFP-expressing foci were consistently retained within selected fields of analysis. Specific regions of the series measuring 300 x 400 pixels, were then selected for further analysis to provide GFP Intensity measurements using ImageJ software. Batch images were separated into the red, green and blue channels and GFP-expressing areas were identified using the threshold feature of ImageJ. After subtracting the background fluorescence (subtraction of gray values of non-expressing pixels from every pixel) in the respective red and green channels, GFP intensity was calculated by multiplying the mean grayscale value per pixel by the total number of GFP-expressing pixels in each channel, and then adding those values for both the red and green channels. GFP Intensity values were collected for all 100 time points to yield expression profiles. Variations in GFP expression profiles resulted from differences in factors such as promoter strength, presence of a silencing suppressor, or nature of the promoter. In addition to quantification of GFP intensity, the image series were also used to generate time-lapse animations using ImageReady. Time-lapse animations revealed that the clear majority of cells displayed a relatively rapid increase in GFP expression, followed by a slow decline. Some cells occasionally displayed a sudden loss of fluorescence, which may be associated with rapid cell death. Apparent transport of GFP across the membrane and cell wall to adjacent cells was also observed. Time lapse animations provided additional information that could not otherwise be obtained using GFP Intensity profiles or single time point image collections.

We report a method for introduction, tracking and quantitative analysis of GFP expression in plant cells. This method utilizes a custom-designed robotics system for semi-continuous image collection from large numbers of samples, over time. We also demonstrate the use of ImageJ and ImageReady for analysis of image series.

Robótica y Análisis de Imagen Dinámica de Estudios de la expresión génica en los tejidos vegetales

Gene expression in plant tissues is typically studied by destructive extraction of compounds from plant tissues for in vitro analyses. The methods ...

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

El uso de un contador de células automatizado para simplificar estudios de expresión génica: siRNA Derribo de IL-4 la expresión génica en células dependientes Namalwa

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

Las secciones incluidas en parafina y congeladas de Drosophila Los músculos de Adultos

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

En la reconstitución in vitro de los activos T. castaneum telomerasa

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

Análisis de RNA Global Síntesis en el nivel de células individuales siguiente Hipoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are a frequent problem affecting human health. Therefore, understanding the mechanisms that regulate metabolism is a crucial scientific task. Many disease causing genes in humans have a fly homologue, making Drosophila a good model to study signaling pathways involved in the development of different disorders. Additionally, the tractability of Drosophila simplifies genetic screens to aid in identifying novel therapeutic targets that may regulate metabolism. In order to perform such a screen a simple and fast method to identify changes in the metabolic state of flies is necessary. In general, carbon dioxide production is a good indicator of substrate oxidation and energy expenditure providing information about metabolic state. In this protocol we introduce a simple method to measure CO2 output from flies. This technique can potentially aid in the identification of genetic perturbations affecting metabolic rate.

Measurement of Metabolic Rate in Drosophila using Respirometry

Metabolic disorders are among one of the most common diseases in humans. The genetically tractable model organism D. melanogaster can be used to identify novel genes that regulate metabolism. This paper describes a relatively simple method which allows studying the metabolic rate in flies by measuring their CO2 production.