El objetivo de este protocolo es visualizar agregados de heterocromatina en células de Drosophila. Para lograr esto, utilizamos células politensas que se encuentran en las glándulas salivales de larvas de tercer estadio El genoma de estas células se amplifica casi mil veces, y los cromosomas conservan las características de las células de interfaz. Tienen telómeros bien definidos, y puentes llamados cromocentro en los que se agregan todos los centrómeros, y es principalmente heterocromático.
Utilizando el tejido larvario del tercer estadio, también nos permite evaluar el cambio en los agregados heterocromáticos en diferentes mutantes genéticos de fondo. Para optimizar el cultivo de larvas de tercer estadio, primero deberá recolectar de 5 a 10 días adultos mayores y poner alrededor de 50 en una botella de cuello ancho de un medio estándar. 25 hombres y 25 mujeres.
Coloque la botella en una incubadora de temperatura controlada a 25 grados Celsius durante 12 horas. Después de que el tiempo de incubación haya terminado, retire los adultos y transfiéralos a una nueva botella para repetir el procedimiento. Deje que los embriones crezcan a 18 grados centígrados durante 22 horas.
Para la recolección de larvas, asegúrese de elegir las larvas errantes, que no tienen esféricos no hablados. Diseccione 15 pares de glándulas salivales, o tanto como pueda en un período de 30 minutos en PBS frío con inhibidores de protesta bajo el microscopio. Transfiera las glándulas salivales a otro tubo con PBS helado.
Lavar una vez con PBS frío más inhibidores de protestas. Recuerde, siempre espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo. Después de quitar el PBS del último paso, agregue directamente 0.5 mililitros de un tampón de fijación de encías del grupo X y 50% de metanol más 2% de formaldehído.
Incubar durante dos horas a cuatro grados celsius con rotación suave. Realice un lavado de rotación de cinco minutos con tampón Tris-Triton, añadiendo un mililitro. Siempre espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo.
Nota: espere a que el tejido llegue a la parte inferior del tubo. Incubar las glándulas salivales con Tris-Tritón, el mismo que el anterior, más un 1% de beta mercaptoetanol durante dos horas a 37 grados centígrados con temblor leve. Lavar con tampón BO3 e incubar con BO3 más TDT milimolar a 37 grados Centígrados con temblores leves durante 15 minutos.
Al final del período de incubación, realice un lavado con un mililitro de tampón BO3 solo. Incubar las glándulas salivales en un mililitro de tampón B durante dos horas a temperatura ambiente con rotación. Retire todo el tampón B y agregue el tampón A más el anticuerpo de interés.
En este caso, utilizamos HP uno, A C 1 8 9 del banco Iridium. 1 en 3, 000 durante la noche a cuatro grados con rotación. En este punto es importante que la sacudida no levante burbujas, lo que podría dañar el anticuerpo.
Dar tratamiento por 15 minutos lavados con tampón B, bajo agitación a temperatura ambiente usando un milímetro cada vez. Las glándulas se transfieren al tampón B junto con la pareja de antibióticos secundarios a un suelo durante dos horas, bajo rotación a cuatro grados. En este paso, es importante cubrir el tubo con papel de aluminio para proteger el anticuerpo secundario de la luz.
Realizar arandelas de 2x15 minutos a temperatura ambiente, mientras se rota con un mililitro de tampón B.Incubar con un marcador de ADN como Sydox u OH, y disolver en un mililitro de tampón B durante 10 minutos a temperatura ambiente con rotación. Realice un lavado con tampón B y una vez con PBS, cada lavado con una duración de 10 minutos, mientras gira a temperatura ambiente. Finalmente, monte las glándulas salivales en un tobogán, haciendo que una piscina con un resbalón de cubierta.
Poner las glándulas salivales en el centro de la piscina y cubrir con Sidiflor. Para evitar la deformación de la burbuja, extendiendo el líquido viscoso por todo el lugar. Luego, selle todas las diapositivas con esmalte de uñas transparente.
Observar bajo un microscopio de fluorescencia o confocal. Si la muestra no se va a observar el mismo día, entonces almacenar de la luz a cuatro grados. Los resultados representativos de la monostensión de HB1 en las glándulas salivales de Drosophila se muestran en la figura uno.
Un resultado positivo es observar un punto focal como en A, agregado cromático atero o condensado. Un resultado negativo es ninguna señal o una señal dispersa. A veces, una señal doble se puede observar como un punto doble en C, pero generalmente ocurre en cantidades más pequeñas.
Para analizar los datos se pueden representar como un gráfico de barras, comparando la distribución de HP1 con diferentes fondos mutantes. Por ejemplo, en la figura dos, podemos ver que el 98% de los núcleos presentan una distribución de un punto. Y el 2% de dos focos en tipo salvaje.
En el mutante, la proporción cambió, y la presencia de dos focos aumentó al 40% la figura tres muestra la trimetilación representativa de lisina 9H3 en monostaining. Resultado en drosophila glándulas salivales observando un punto focal en B, es un resultado favorable en el agregado cromático o condensado, una señal doble o triple en C puede verse en raras ocasiones, pero en pequeñas cantidades. Al final de este protocolo, podrás ver un condensado diacricomático de la proteína HP1 a pesar de las limitaciones de estado, será un buen primer acercamiento.
