Este protocolo se puede utilizar para caracterizar la dinámica de la miosina no muscular a nivel de proteína, lo que puede informar las propiedades móviles que contribuyen a su papel en las células. Este es un método rápido, reproducible y altamente controlado que se puede utilizar para estudiar los efectos de diversas condiciones reguladoras sobre la motilidad de la miosina, informando sus comportamientos celulares. Estas técnicas se pueden utilizar para investigar cómo las mutaciones causantes de enfermedades en las miosinas no musculares afectan sus comportamientos a nivel de molécula única y conjunto.
El enfoque general de su metodología se puede aplicar a varios otros sistemas citoesqueléticos, como la caracterización de quinesinas purificadas y dineínas con microtúbulos. La versatilidad de este protocolo puede plantear preguntas sobre qué fluoróforos y condiciones químicas son los más apropiados, pero el método se puede optimizar con relativa rapidez. Comprender cómo configurar y recubrir las cámaras de flujo crea una base sólida sobre la cual uno puede adaptarse a diversas condiciones para estos experimentos.
Para comenzar, prepare una solución de nitrocelulosa al uno por ciento en acetato de amilo y coloque un papel de filtro circular con un diámetro de 125 milímetros en la parte inferior de una placa de cultivo de tejidos. Cargue ocho hojas cuadradas en una rejilla y lávelas a fondo con aproximadamente dos a cinco mililitros de etanol a prueba de 200 seguidos de dos a cinco mililitros de agua destilada. A continuación, conduzca los deslizamientos de la cubierta completamente utilizando una línea de aire filtrada o una línea de nitrógeno.
Pipetee lentamente 10 microlitros de solución de nitrocelulosa al uno por ciento a lo largo de un borde de un deslizamiento de cubierta. Untarlo en el resto del deslizamiento de la cubierta usando el lado de una punta de pipeta de 200 microlitros en un movimiento suave. Luego coloque este resbalón de la cubierta en el plato de cultivo de tejidos con el lado de nitrocelulosa hacia arriba.
Repita esto para los resbalones de la cubierta restantes y deje que se sequen. Limpie un portaobjetos de microscopio con un papel de lente óptica para limpiar los escombros grandes. Corte dos trozos de cinta adhesiva de doble cara, de aproximadamente dos centímetros de longitud, y coloque una pieza a lo largo del centro del borde largo del portaobjetos del microscopio.
Coloque el segundo trozo de cinta aproximadamente dos milímetros por debajo del primer trozo de cinta de tal manera que los dos sean paralelos creando una cámara de flujo que pueda contener aproximadamente 10 microlitros de solución. Pegue con cuidado uno de los deslizamientos de la cubierta de nitrocelulosa sobre la cinta para que el lado recubierto con nitrocelulosa esté en contacto directo con la cinta. Con una punta de pipeta, presione suavemente hacia abajo en la interfaz de la cinta deslizante para asegurarse de que el deslizamiento de la cubierta se adhiera correctamente a la diapositiva.
Luego corte el exceso de cinta que cuelga sobre el borde de la diapositiva con una cuchilla de afeitar. Prepare las soluciones para Myosin 5a y manténgalas en hielo. Fluya en 10 microlitros de la Myosin 5a a través de la cámara de flujo deslizante y espere un minuto.
Luego fluye en 10 microlitros de un miligramo por mililitro BSA en tampón motilidad con TDT. Repita esto dos veces y espere un minuto después del tercer lavado. Use la esquina de un papel de seda o papel de filtro para absorber la solución a través del canal colocando suavemente la esquina del papel en la salida de la cámara de flujo.
A continuación lavar con 10 microlitros de tampón motilidad con TDT. Pipetee la solución de actina negra con una jeringa de un mililitro y una aguja calibre 27 para cortar los filamentos de actina antes de introducir esa solución en la cámara. Añadir la actina negra a la cámara en presencia de un ATP milimolar en 50 MILIMOLARES MB con una TDT milimolar.
A continuación, flujo en 50 microlitros de tampón motilidad con TDT y un milimolar ATP para agotar la cámara de filamentos de actina libre. Lavar con 10 microlitros de tampón motilidad con TDT tres veces para agotar la cámara de cualquier ATP. Flujo en 10 microlitros de solución de actina RH nanomolar que contiene tampón de motilidad con TDT y espere un minuto para permitir la unión de rigor de los filamentos de actina a la Miosina 5a unida a la superficie del deslizamiento de la cubierta.
Lavar con 10 microlitros de tampón de motilidad de 50 milimolares con TDT dos veces para eliminar los filamentos de actina RH no unidos. Flujo en 30 microlitros de buffer final. Grabe imágenes en un microscopio de fluorescencia utilizando una longitud de onda de excitación de 561 nanómetros para visualizar la actina RH.
Prepare las soluciones para el ensayo de motilidad invertida Myosin 5a y manténgalas en hielo. Lavarlos en cámara con 10 microlitros de tampón motilidad con TDT. Flujo en 10 microlitros de un miligramo por mililitro BSA en tampón motilidad con TDT.
Repita esto dos veces, esperando un minuto después del tercer lavado. Use papel de papel o papel de filtro para absorber la solución a través del canal colocando suavemente la esquina del papel en la salida de la cámara de flujo. A continuación, lavar la cámara con 10 microlitros de tampón motilidad con TDT tres veces.
Flujo en 10 microlitros de la solución NeutrAvidin en tampón motilidad con TDT y espere un minuto. Luego lavar con 10 microlitros de esa solución tres veces. Flujo en 10 microlitros de actina BRH que contienen tampón de motilidad con TDT utilizando una punta de pipeta de gran perforación.
Y espera un minuto. A continuación, lavar con 10 microlitros de tampón motilidad con TDT tres veces. Flujo en 30 microlitros de tampón final con 10 nanomolares De Miosina 5a.
Y cargue inmediatamente en el microscopio de fluorescencia de reflexión interna total. Comience a grabar una vez que se encuentre el enfoque óptimo para las imágenes TIRF. La purificación de la miosina 2b no muscular, las cadenas ligeras esenciales y las cadenas ligeras reguladoras, así como la miosina 5a y la calmodulina se evaluaron mediante la realización de SDS-PAGE.
El ensayo de filamento de actina deslizante muestra las características de una película ideal y rastreable con movimientos suaves de filamentos de actina etiquetados. El lavado de actina negra aseguró que las cabezas de miosina muertas se eliminaran del campo de medición, lo que contribuyó aún más al movimiento suave general de los filamentos de actina. Se obtuvieron imágenes de salida de seguimiento de filamentos del programa de vía rápida para Myosin 2b y Myosin 5a no musculares.
Un histograma representativo muestra que la velocidad de deslizamiento de actomiosina 2b es de 77 nanómetros por segundo. Y el de Actomyosin 5a es de 515 nanómetros por segundo. En ausencia de metilcelulosa, los filamentos de actina no permanecen tan estrechamente asociados por la superficie recubierta de miosina, lo que hace que se caiga cerca de la superficie de los deslizamientos de la cubierta no muscular recubierta de miosina 2b.
El movimiento de la miosina se observó en filamentos de actina fluorescentes atados a la superficie utilizando el ensayo de motilidad invertida. Es importante esquilar la actina no etiquetada antes de introducirla en la celda de flujo para el lavado de actina negra, lo que permitirá la translocación suave de la actina. Experimentos adicionales pueden investigar cómo la motilidad de la miosina se ve afectada por las mutaciones de la miosina, las proteínas que inducen la carga, la fuerza iónica y las proteínas reguladoras.
Se pueden reconstituir varias condiciones celulares para estudios futuros. Estos métodos permiten las investigaciones bioquímicas y biofísicas sobre cómo varias isoformas de miosina varían en sus propiedades móviles y mecánicas a nivel de molécula única y conjunto.
