La Saccharomyces cerevisiae kinesin-5 Cin8 es una proteína motora bidireccional. Cin8 se mueve en la dirección del extremo inferior de los microtúbulos como una sola molécula, y cambia la direccionalidad bajo una serie de condiciones experimentales diferentes. El objetivo general de nuestra investigación es comprender el mecanismo de la motilidad bidireccional mediante el estudio de factores y elementos estructurales que regulan la motilidad bidireccional de Cin8.
Este protocolo explica exhaustivamente la purificación de Cin8 de longitud completa tipo GFP sobreexpresado en células de levadura, el ensayo de motilidad de molécula única y el posterior análisis de las propiedades móviles de moléculas individuales y grupos de Cin8. Esta separación es importante, ya que la direccionalidad de Cin8 se ve afectada por su acumulación en grupos en el microtúbulo. Esta técnica se puede adaptar fácilmente para purificar otras proteínas nucleares de la levadura.
Además, se puede aplicar a cualquier partícula fluorescente que deba separarse en grupos de tamaño en función de su intensidad de fluorescencia. Mary Popov, nuestra gerente de laboratorio, la Dra. Alina Goldstein-Levitin, y la Dra. Nurit Siegler, becarias postdoctorales; Tatiana Zvagelsky, Maya Sadan, y Shira Hershfinkel, estudiantes de posgrado; y Neta Yanir, Yahel Abraham, Roy Avraham y Meital Haberman, estudiantes de pregrado de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive células de Saccharomyces cerevisiae que contengan el plásmido para la sobreexpresión de Cin8-GFP-6Sí a la fase de crecimiento exponencial en un litro de medio selectivo de levadura, complementado con 2% rafinosa a 28 grados centígrados.
Luego induzca la sobreexpresión de Cin8-GFP-6His agregando 2% de galactosa, y monitoree el crecimiento del cultivo de levadura midiendo la absorbancia a 600 nanómetros. Cinco horas después de la adición de galactosa, cosechar las células por centrifugación. Vuelva a suspender las células en tampón de lisis y congélelas en nitrógeno líquido.
A continuación, utilizando un mortero refrigerado y un mortero, moler las células congeladas en nitrógeno líquido. Siga agregando nitrógeno líquido durante la molienda, de modo que los extractos permanezcan congelados. Monitoree la lisis celular bajo un microscopio de contraste de fase o interferencia diferencial.
Luego descongele las celdas de tierra y centrífuguelas. Cargue el sobrenadante en una columna de flujo por gravedad llena de dos mililitros de níquel-NTA y equilibre previamente con un tampón de lisis. Deje que el sobrenadante fluya a través de la columna.
Lave la columna con cinco volúmenes de columna de tampón de lisis, seguido de cinco volúmenes de columna de tampón de lisis complementados con imidazol de 25 milimolares. A continuación, eluya el Cin8-GFP-6His con tampón de elución. Analizar las muestras eluidas por fraccionamiento SDS-PAGE, seguido de tinción azul de Coomassie y análisis de Western blot sondeado con anticuerpos anti-GFP.
Después de agrupar las fracciones que contienen Cin8-GFP-6His, purificarlas mediante cromatografía de exclusión de tamaño a un caudal de 0,5 mililitros por minuto y un límite de presión de columna de 1,5 megapascales. Monitoree simultáneamente la absorbancia a 280 nanómetros. Recoger las fracciones correspondientes al tetrámero Cin8-GFP y analizarlas mediante SDS-PAGE y Western blotting.
Luego alícuota las fracciones seleccionadas, congele y almacene hasta su uso a menos 80 grados centígrados. Para polimerizar y estabilizar los microtúbulos marcados con biotina y rodamina, mezcle los componentes de la reacción en un tubo de 1,5 mililitros e incube la mezcla durante una hora a 37 grados centígrados. Luego agregue 80 microlitros de tampón de tubulina general caliente, mezcle con cuidado y centrífuga.
Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con cuidado mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo con 50 microlitros de tampón de tubulina general caliente. Luego guarde la suspensión a 28 o 37 grados centígrados. Examine los microtúbulos con un microscopio de fluorescencia, utilizando el canal de rodamina de 647 nanómetros.
A continuación, retire el papel protector de las tiras de cinta y coloque una cubierta silanizada en las tiras para crear tres cámaras de flujo de volumen de 10 microlitros. A continuación, realice el recubrimiento de avidina de la cubierta mediante la adición secuencial de los reactivos indicados. Incubar el cubrehojas durante tres a cinco minutos antes de lavarlo con 80 microlitros de tampón de tubulina general.
A continuación, conecte los microtúbulos biotinilados a los cobertores recubiertos de b-BSA / avidina insertando 20 microlitros de microtúbulos en la cámara de flujo. Incubar los portaobjetos con la cubierta hacia abajo en una cámara de humedad oscura durante cinco minutos a temperatura ambiente. Luego lave las diapositivas con 200 microlitros de tampón de tubulina general.
A continuación, aplique 30 microlitros de mezcla de reacción de motilidad seguidos de motores Cin8-GFP diluidos en 20 microlitros de la mezcla de reacción de motilidad en la cámara de flujo, e inmediatamente proceda a obtener imágenes del movimiento de los motores a lo largo de los microtúbulos. Para las imágenes de motilidad motora, coloque una gota de aceite de inmersión en el objetivo del microscopio, luego coloque la cámara de flujo en la etapa del microscopio fluorescente, con la cubierta orientada hacia el objetivo. Encienda el canal de rodamina para enfocar los microtúbulos unidos a la superficie de la cubierta.
Luego, utilizando el software ImageJ Micro-Manager, adquiera la imagen con una exposición de 20 milisegundos. A continuación, encienda el canal GFP y adquiera 90 imágenes de lapso de tiempo con un intervalo de un segundo y una exposición de 800 milisegundos. En el software ImageJ Fiji, abra la película de lapso de tiempo y la imagen de campo de microtúbulos correspondiente.
Sincronice estas dos ventanas eligiendo Analizar, seguido de Herramientas y Sincronizar ventanas. Para obtener un kymograph, resalte un microtúbulo usando la opción Línea segmentada. A continuación, en Analizar, seleccione la pestaña Multi Kymograph.
Para determinar el tamaño del clúster de las moléculas Cin8-GFP, realice la sustracción y corrección de fondo para una iluminación desigual haciendo clic en Procesar, seguido de Restar fondo. Establezca el radio de la bola rodante en 100 píxeles y marque la opción Paraboloide deslizante. A continuación, realice un seguimiento de un motor Cin8-GFP no móvil específico utilizando el complemento TrackMate del software ImageJ Fiji.
Elija Plugins, seguido de Tracking, TrackMate, LoG detector y Simple LAP tracker para seguir la intensidad media de fluorescencia del motor Cin8-GFP en función del tiempo dentro de un círculo de cuatro píxeles de radio. Después de repetir el procedimiento para diferentes motores Cin8-GFP, trace las intensidades de fluorescencia en función del tiempo. A continuación, para rastrear la motilidad de las moléculas Cin8-GFP a lo largo de las pistas de microtúbulos, recorte los microtúbulos que se analizarán en la secuencia de lapso de tiempo de los fotogramas grabados resaltándolo con la herramienta de rectángulo y haciendo clic en Imagen, seguido de Recortar.
Elija una partícula fluorescente Cin8-GFP para el análisis. Registre las coordenadas de partícula en cada fotograma de la secuencia de lapso de tiempo utilizando la herramienta de punto y las opciones Medir. Del mismo modo, registre las coordenadas de otras partículas fluorescentes en la secuencia de lapso de tiempo.
A continuación, asigne el tamaño del clúster a todas las partículas Cin8-GFP examinadas en el primer fotograma de su aparición, como se demostró anteriormente. A continuación, utilizando la fórmula indicada y las coordenadas de movimiento Cin8-GFP determinadas, calcule los desplazamientos de Cin8-GFP en cada punto de tiempo con respecto a las coordenadas iniciales. A partir de estos valores de desplazamiento, calcule el desplazamiento para todos los intervalos de tiempo posibles para una partícula Cin8-GFP especificada.
Repita el procedimiento para todas las partículas Cin8-GFP examinadas. Finalmente, grafique el desplazamiento medio de todas las partículas Cin8-GFP examinadas frente al intervalo de tiempo, y sometalo a un ajuste lineal. La pendiente de este ajuste representa la velocidad media de las partículas móviles de Cin8-GFP.
Las características de motilidad de la proteína motora bidireccional Cin8 de diferentes tamaños de racimo en microtúbulos individuales se muestran aquí. Para cada categoría de tamaño de clúster, se extrajeron más de 40 trayectorias de Cin8-GFP individuales de las grabaciones. El trazado de los desplazamientos medios de moléculas individuales y grupos de motores Cin8 en función del intervalo de tiempo demostró que las moléculas individuales de Cin8-GFP se mueven de una manera unidireccional menos dirigida al extremo con alta velocidad.
En contraste, los cúmulos Cin8 exhiben una menor velocidad y una mayor motilidad bidireccional. Al realizar este procedimiento, se debe usar proteína motora de alta pureza para evitar cualquier contaminación que pueda afectar la agrupación motora. Al analizar la intensidad de la fluorescencia motora, es importante examinar los motores en el primer marco en que aparecen, para evitar el efecto del fotoblanqueo.
Al estudiar la motilidad de los motores bidireccionales, es extremadamente importante analizar por separado moléculas individuales y grupos, ya que la agrupación motora es uno de los factores clave que afectan la direccionalidad motora.
