Nuestro protocolo permite a los investigadores construir motivos citoesqueléticos a partir de componentes purificados y medir directamente las fuerzas que generan estas redes para comprender cómo funcionan estos componentes mecánicos de la célula tanto en estados sanos como en estados de enfermedad. Este método nos permite cuantificar las fuerzas y correlacionar estos números directamente para mantener los parámetros de las proteínas involucradas, incluida la concentración y densidad de proteínas. Parámetros que generalmente son imposibles de adquirir dentro de la célula.
Este método puede proporcionar información sobre cualquier tipo de red de citoesqueleto, como las involucradas en la mitosis o el desarrollo neuronal. Se puede adaptar fácilmente para estudiar las redes involucradas en la contracción muscular o la migración celular simplemente intercambiando estas proteínas específicas que se utilizan. El aspecto más complicado de este método es la coordinación de las diferentes tecnologías, que incluyen una trampa óptica de haz único y un microscopio TIRF.
Además, los experimentos de una sola molécula requieren una preparación cuidadosa de las superficies, como el cubreobjetos, por lo que es primordial preparar muestras de alta calidad. Comience con la construcción de una cámara de humedad colocando un pañuelo doblado y sin pelusa humedecido con agua ultrapura en el fondo de una caja de punta de pipeta vacía. Introduce todos los reactivos pipeteando el líquido en un extremo del canal y absorbiendo el líquido en el extremo opuesto.
Usando una punta de pipeta en ángulo de 20 microlitros, fluya lentamente en 10 microlitros de 0,5 miligramos por mililitro de estreptavidina o NeutrAvidin. Incubar el portaobjetos en la cámara de humedad durante 4 minutos con el cubreobjetos hacia abajo. Enjuague la cámara con 20 microlitros de un 1x BRB80 usando un pañuelo sin pelusa para extraer líquidos.
Después de repetir los reactivos que fluyen y la incubación una vez más, enjuague con 10 microlitros de 0,5 miligramos por mililitro de solución bloqueadora de caseína. Introduzca 10 microlitros de microtúbulos rojos biotinilados diluidos en la cámara, luego enjuague la cámara con 20 microlitros de 1x BRB80. Después de fluir el reactivo e incubar como se demostró anteriormente, enjuague el paso con 10 microlitros de una concentración apropiada de proteína no motora a estudiar, luego fluya en 10 microlitros de microtúbulos de rodamina y repita la incubación y el lavado.
A continuación, combine 1 microlitro de perlas recubiertas de quinesina rigurosa y 19 microlitros de tampón de reacción. Selle ambos bordes de la cámara con esmalte de uñas transparente y espere hasta que el esmalte se seque. Emplear un instrumento de microscopio invertido que tiene capacidades totales de imágenes de fluorescencia de reflexión interna, y en el que se ha construido una trampa óptica de un solo haz.
Agregue 1 gota de aceite de inmersión en el cubreobjetos de la cámara de muestra. Con el lado deslizante de la cubierta de la cámara de muestras hacia abajo, coloque la muestra que se va a fotografiar en la plataforma del microscopio. Levante lentamente el objetivo para que haya contacto entre el deslizamiento de la cubierta y el objetivo a través del aceite.
Ajuste la altura del objetivo para que la superficie de deslizamiento de la cubierta de la cámara de muestras esté enfocada. Grabe imágenes de un solo fotograma de las muestras en los tres canales. Para los experimentos aquí, use de 100 a 200 milisegundos de exposición.
Ajuste la potencia del láser para lograr una buena relación señal-ruido de las muestras mientras minimiza el blanqueo fotográfico durante 2 a 5 minutos cuando se ensaya el paquete individual. La frecuencia de los haces de microtúbulos por campo de visión debe ser de aproximadamente tres a cuatro haces de microtúbulos por 100 microlitros por 100 microlitros de campo de visión por cámara. Observe la densidad de las perlas en la muestra utilizando un campo brillante y el objetivo 100x en el microscopio.
Emplee una concentración de cuentas tal que las perlas estén a un mínimo de 10 micrómetros entre sí en promedio, y asegúrese de que estén libres de cualquier tipo de confinamiento superficial o agrupamiento. Asegúrese de que los microtúbulos biotinilados de color rojo lejano estén firmemente unidos a la superficie de la cubierta y que la rodamina sin movimiento browniano visible. Asegúrese de que los microtúbulos de rodamina estén unidos a los microtúbulos biotinilados a través del mapa de reticulación y fluctúen visiblemente en sus extremos libres.
Identifique un haz de microtúbulos adecuado que contenga solo dos microtúbulos, uno biotinilado con unión superficial completa y un microtúbulo no biotinilado que esté parcialmente libre en solución y alineado en el eje x o y. Utilice la trampa óptica para capturar una cuenta libre que demuestre el movimiento browniano. Una vez que la cuenta haya sido atrapada, mueva cuidadosamente la cuenta al haz de microtúbulos seleccionado, asegurándose de que no se tire de otras cuentas en la trampa en el proceso.
Asegúrese de que la perla esté a varias micras de distancia de la región de superposición que contiene proteínas de reticulación. Baje con cuidado el cordón en el eje z hasta que haga contacto con el borde del segmento libre del microtúbulo de rodamina. Tire hacia arriba suavemente y muévase perpendicular al eje de los microtúbulos para verificar la fijación observando la flexión del microtúbulo de rodamina y siguiendo la posición del talón.
Realinee cuidadosamente el microtúbulo de rodamina a lo largo del eje de microtúbulos del microtúbulo unido a la superficie moviendo la etapa de nanoposicionamiento y configure los parámetros para la extracción automática del haz de microtúbulos. Establezca la dirección a lo largo del eje paralelo de los microtúbulos. Establezca la velocidad de tracción deseada y el tiempo de tracción deseado en función de la longitud de superposición.
Comience a grabar datos de fluorescencia en los tres canales a una velocidad de 1 a 2 fotogramas por segundo. Utilice las potencias optimizadas del láser y los tiempos de exposición. Inicie el movimiento automatizado de la etapa y registre los datos de captura desde la etapa del detector sensible a la posición y la etapa de la cámara de fluorescencia de reflexión interna total.
Desactive las trampas para liberar la cuenta y repita el experimento como desee. Los conjuntos de la proteína motora mitótica esencial quinesina-5 pueden regular el deslizamiento de los microtúbulos generando fuerzas de empuje y frenado que se escalan linealmente con la longitud de superposición. Se encontró que el dominio de cola C-terminal es necesario para la reticulación eficiente y la generación de fuerza.
La proteína de longitud completa es capaz de generar fuerzas sostenidas que se estabilizan cuando todas las proteínas motoras alcanzan su fuerza de pérdida individual. Sin embargo, el motor de kinesina-5 que carece de su cola C-terminal genera fuerzas máximas que son casi cinco veces más pequeñas en magnitud. Los conjuntos de la proteína mitótica no motora PRC1 operan como una vaina mecánica para resistir el deslizamiento de microtúbulos en la zona media del huso anafásico.
Las fuerzas resistivas no dependen de la longitud de las regiones de superposición entre los pares de microtúbulos o de la densidad local de reticulación, pero sí dependen en gran medida de la concentración total de moléculas PRC1 comprometidas. Este método se puede adaptar para estudiar diversos sistemas biológicos, como la organización microbiana y las neuronas, mediante el uso de proteínas alternativas. También se puede ampliar fácilmente para analizar geometrías de red basadas en actina para estudiar la contracción muscular o la motilidad celular.
Esta técnica permite estudiar geometrías totales celulares únicas, donde los filamentos son tanto de seguimiento como de carga y están organizados por pequeños conjuntos de proteínas. Estas geometrías imitan mejor lo que está sucediendo en las células durante numerosos procesos biológicos.
