Este trabajo fue apoyado por el NIH subvenciones 068.625, becas NSF 1063188 y Centro de Física de Células Vivas 0822613. Un agradecimiento especial al Dr. Marina Marjanovic en Beckman Instituto de Ciencia y Tecnología Avanzada para el regalo de los ojos del conejo.

Declaración de Ética: El tejido de la córnea de conejos se recogió de acuerdo con la Universidad de Illinois Institucional Cuidado de Animales y el uso de directrices. Configuración 1. TIRFM NOTA: Use gafas láser de seguridad todo el tiempo. <ol><li> Asegúrese de que todos los componentes ópticos necesarios que figuran en la Lista de Materiales están disponibles y listos para la alineación. Si es necesario, use sustitutos con funciones equivalentes de otras compañías. Asegúrese de que los espejos y las lentes deben tener (AR) recubrimientos antirreflectantes que coinciden con el láser en uso. </li><li> Establecer las alturas de todos los componentes ópticos a la altura del centro del microscopio de nuevo puerto. </li><li> Montar el láser, disparo de láser y el filtro ND (s). Uso de filtros ND para atenuar la potencia del láser hacia abajo tan bajo como sea posible mientras se mantiene el haz visible. Apriete los tornillos con llaves hexagonales apropiadas. </li><li> Planee una ruta de viga y marcarlo con cinta o marcador en la mesa óptica (puntoted líneas azules en la Figura 1). Para simplificar, mantener caminos rectos a lo largo de las líneas de agujeros en la mesa óptica. </li><li> Lugar espejo M1 (Figura 1) en el primer giro en ángulo recto. Coloque los dos iris lo largo de la segunda sección recta de la trayectoria del haz planeado. Ajustar la posición y la inclinación de M1 tal que el láser pasa a través de los iris. </li><li> Lugar espejo M2 (Figura 1) en el segundo giro en ángulo recto. Coloque el expansor de haz de 10X (L1 y L2, la Figura 1) a lo largo de la tercera sección recta de la trayectoria. Ajustar su inclinación tal que el expansor de haz es paralelo tanto a la mesa óptica y la trayectoria del haz planeado. <ol><li> Ajuste M1 y M2 iterativamente de manera que el láser va recto a través de los centros de ambas lentes del expansor de haz. Repita este paso hasta que el perfil de la viga de la viga ampliado no es recortado de Gauss. </li></ol></li><li> Ajuste M1 para centrar el haz en L1 (Fifigura 1) y M2 para centrar el haz sobre L2 (Figura 1) de manera iterativa. Un perfil del haz mala por lo general significa que el láser se recorta; usar un pedazo de papel blanco para bloquear el haz después del expansor de haz para comprobar el perfil del haz con los ojos. Para el análisis de alta precisión, utilizar un perfilador haz óptico. </li><li> Ajustar la distancia entre L1 y L2 de tal manera que el haz se colima. Repita el paso 1.8 y 1.9 si es necesario. NOTA: Cuando el tamaño del haz no cambia con la distancia, el haz colimado es suficiente para una configuración TIRFM. Para mejorar aún más la colimación del haz, se podrían utilizar herramientas tales como un interferómetro de cizalladura. Un típico tamaño del haz después de la expansión es de ~ 20 mm. </li><li> Obturador del láser. Aflojar el objetivo del microscopio y el tornillo en un objetivo de alineación fluorescente. Lugar espejos M3 y M4 (Figura 1) para dirigir el haz expandido en el puerto de microscopio y sobre el espejo dicroico dentro de la torreta. Asegúrese de que el rayo láser rebota en tél dicroico y hacia el techo. </li><li> Ajuste M3 para centrar la parte más brillante del haz sobre el blanco fluorescente, y M4 para ajustar la inclinación del haz de ser vertical. </li><li> Obturador del láser y atornillar el objetivo de nuevo. Si la alineación en el paso anterior se hace bien debe haber un punto simétrico de salir del objetivo. Perfeccionar las inclinaciones de M3 y M4 para optimizar la potencia del láser y perfil del haz fuera del objetivo. </li><li> Montar una cámara EMCCD al microscopio y conecte la cámara a un ordenador. Inicie el software de la cámara. </li><li> Montar una muestra fluorescente (solución de fluoróforos) en el microscopio. Mira la mancha fluorescente brillante en la cámara. Compruebe que el punto no se desplaza en la pantalla a medida que cambia el enfoque. </li><li> Coloque la lente TIR (L3, Figura 1) en la etapa de traducción XYZ a una distancia desde el plano focal posterior del objetivo que es igual a la longitud focal de L3 (~ 30 cm). Ajuste la posición de L3de tal manera que el láser pasa a través del centro de la lente. </li><li> Traducir L3 a lo largo de la trayectoria del haz para ajustar la colimación del haz. Asegúrese de que el haz se sigue centrada en el monitor y simétrica en forma. NOTA: El área de iluminación en el plano de la muestra aumenta con la disminución de la lente TIR longitud focal. En general, utilice la longitud focal más pequeño que podría caber en el set-up. </li><li> Traducir L3 perpendicular a la trayectoria del haz para inclinar el haz fuera del objetivo. Mantener la traducción de la lente TIR TIR de tal manera que se consigue. Observar una muestra de perlas fluorescentes a través de la cámara EMCCD y L3 ajustar para obtener una buena SNR. </li></ol><img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. configuración óptica para la microscopía de reflexión interna total de fluorescencia (TIRFM). 2. FIONA en Cy3-ADN <ol><li> Cdiapositivas de microscopio y cubreobjetos magras: Limpiar los portaobjetos y cubreobjetos con ddH2O e isopropanol y secarlos con nitrógeno gaseoso; Colocar los portaobjetos y cubreobjetos en el limpiador de plasma durante 5 min bajo argón plasma. </li><li> Construir cámaras de muestra (como esbozado en la Figura 2). <ol><li> Coloque un pañuelo en el banco y luego poner un pedazo de papel de la lente en la parte superior del tejido. Posicionar el cursor en el papel de la lente. Asegúrese de que el lado limpio de la diapositiva es hacia arriba. </li><li> Aplicar dos tiras de cinta de doble cara sobre el portaobjetos a lo largo de los bordes largos, dejando un espacio de 3-5 mm en el centro. Coloque el cubreobjetos limpiado en la parte superior de la corredera. Asegúrese de que el lado limpio de la cubreobjetos se enfrenta a la diapositiva. </li><li> Utilice una punta de pipeta para presionar hacia abajo sobre la cinta de doble cara. Utilice una maquinilla de afeitar para eliminar el exceso de cinta de la diapositiva para que la cinta sigue siendo sólo bajo el cubreobjetos. NOTA: Los extremos abiertos de la cámara se dejan abiertas y sirven como entrada y salidadejar. El volumen de la cámara es de varios microlitros. </li></ol></li></ol><img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Esquema de una cámara de muestra típica (a) Vista superior.; (B) Vista lateral desde la derecha; (C) La vista lateral de la parte delantera. <ol start="3"><li> Inmovilizar Cy3-ADN en las superficies interiores de las cámaras de muestra. <ol><li> Preparar T-50 tampón (10 mM Tris-HCl pH 8,0, NaCl 50 mM). Preparar BSA-biotina en T-50 a una concentración final de 1 mg / ml. Preparar tampón T50-BSA por disolución de BSA en T-50 a una concentración final de 10 mg / ml. </li><li> Preparar 0,5 mg / ml en tampón de neutravidina T50-BSA. Preparar biotinilado Cy3 ADN marcado (Cy3-DNA) en T50-BSA a una concentración final de 5-10 pM. </li><li> Pipetear 10 l de BSA-biotina (1 mg / ml) en la cámara de muestra. Espere 5 min. </li><li&gt; Lave la cámara con 40 l T50-BSA. Pipetear 10 l neutravidina (0,5 mg / ml) en la cámara de muestra. Incubar durante 5 min. </li><li> Lave la cámara con 40 l T50-BSA. Colocar 20 l Cy3-ADN en la cámara de muestras. Incubar durante 5 min y luego lavar la cámara con 80 l T50-BSA. </li></ol></li><li> Imagen Cy3-ADN moléculas individuales bajo TIRFM. <ol><li> Preparar buffer de imágenes (100 l) mediante la mezcla de 1 l protocatecuato-3,4-dioxigenasa (PCD, 5 M), 4 l de ácido protocatéquico (PCA, 62,5 mM), 50 l 6-hidroxi-2,5,7,8- tetramethylchromane-2-carboxílico (Trolox, 2 mM en T-50), y 45 l T50-BSA. </li><li> Pipetear en buffer de imágenes 30 l y esperar 8-10 min. </li><li> Montar la muestra para formación de imágenes en un TIRFM que está equipado con un láser verde (532 nm), un objetivo de inmersión en aceite 100X (1,45 NA), y una cámara de EMCCD. </li><li> Ajuste el tiempo de exposición a 100 a 500 ms y EM ganancia para 25 a 100 Adquirir una película de la muestra de 1,000 marcos. </li></ol></li><li> Realizar análisis de datos FIONA en las imágenes grabadas de Cy3-ADN. <ol><li> Determinar el tamaño efectivo de píxel (es decir, factor de conversión de píxeles a nanómetros) dividiendo el tamaño de píxel físico (leída de la hoja de especificaciones de la cámara EMCCD) por el aumento total (el aumento del objetivo de microscopio multiplicado por cualquier aumentos adicionales). </li><li> Determinar el factor de conversión de intensidades de los píxeles de fotones números dividiendo sensibilidad CCD (es decir, electrones por conteo A / D, leer la hoja de especificaciones de la cámara CCD) por el multiplicador de electrones (EM) ganancia utilizada durante la adquisición de imágenes. </li><li> Compila y ejecuta FIONA.pro para el análisis FIONA. Utilice este programa IDL para importar la imagen adquirida, para introducir el tamaño de los píxeles efectivos (del Paso 2.5.1) y el factor de conversión de intensidad para el número de fotones (de la etapa 2.5.2), y elegir los puntos para el análisis de FIONA. NOTA: Al final, el program voluntad de salida de los resultados apropiados con funciones gaussianas 2D, así como el número total de fotones y la precisión de la localización. Un resultado típico se muestra en la sección de los resultados y las figuras representativas 4c-4d. </li><li> Compila y ejecuta phcount.pro caracterizar recuento de fotones. Utilice este programa IDL para medir el número medio de fotones emitidos por un fluoróforo antes de photobleaching, para importar la imagen adquirida y para introducir el factor de conversión de intensidad a número de fotones (de la etapa 2.5.2). NOTA: El programa detectará manchas fluorescentes automáticamente (selección manual es una opción), el cálculo de recuentos de fotones en función del número de cuadro, y la salida de los restos de recuentos de fotones. <ol><li> Deseche malas trazas y especificar rangos marco después de photobleaching para la corrección de la línea base. Al final, el programa de salida de una lista de números totales de fotones para todos los puntos no se descarta. Se representa la distribución de los números de fotones y adaptarse a la distribuciónción con un decaimiento exponencial para obtener el número medio de fotones. Un resultado típico se muestra en la sección de resultados representativos y las figuras 4e-4f. </li></ol></li></ol></li></ol> 3. FIONA Aplicada para cuantificar Motor (por ejemplo, la miosina en la actina) Dinámica a escala del nanómetro <ol><li> Polimerizar la actina (es decir, preparar a la actina F) un día antes de FIONA experimento. <ol><li> Reconstituir G-actina (monómero) y biotina G-actina (monómero) a 10 mg / ml con tampón de actina general. Revuelva para asegurarse de que ambos se disuelve por completo, y mantener tanto en el hielo. </li><li> Mezclar 10 l G-actina (monómero) con 1,7 l de biotina G-actina en un tubo de 1.5 ml. Añadir 100 l de tampón de hielo frío polimerización de la actina. </li><li> Deje la mezcla durante la noche a 4 ° C (F-actina formado) y luego añadir ddH2O hasta un volumen total de 1 ml. </li><li> Guarde los filamentos de actina (F-actina) a 4 ° C para su uso posterior en los experimentos. NOTA: Filamentos se desintegrará y acortar el tiempo, pero se puede utilizar durante al menos dos semanas. </li></ol></li><li> Preparar la muestra para la imagen. <ol><li> Hacer una cámara de muestra (como se describe en el Protocolo 2.1 y 2.2). Pipetear en 20 l de BSA biotinilada a 1 mg / ml en ddH2O Incubar durante 10 min. Enjuagar con 30 l ddH 2 O. NOTA: Esto bloquea la superficie de cristal y establece biotina para la unión de los filamentos de actina. Biotinilado poli-L-lisina - polietilenglicol (PEG-PLL) podría servir la misma función. </li><li> Pipetear en 0,5 mg / ml neutravidina. Incubar durante 2 minutos y luego lavar la cámara con tampón M5 30 l. </li><li> Pipetear en el F-actina preparado diluyó 25 veces en tampón de actina en general, a una concentración final ~ 0,004 mg / ml. Espere 10 minutos, enjuague la cámara con 30 l de tampón. </li><li> Diluir la miosina Va con las etiquetas FLAG 30 veces en tampón de M5 (HEPES 20 mM (pH 7,6), 2 mM de MgCl2, 25 mM KCl, 1 mM EGTA) a una concentración final of 250 nM. Mezclar 1 l miosina con 1 l anti-FLAG-Qdot705 (~ 1 M, conjugado de anticuerpos anti-FLAG y Qdot705 utilizando la conjugación Kit Qdot705 anticuerpo de acuerdo con el manual de instrucciones del fabricante). Añadir en 8 l M5 para llenar a 10 l. Pipetear hacia arriba y abajo para mezclar bien. Incubar durante 10 min en hielo. NOTA: Esto produce una mezcla de 1 motor a 4 puntos cuánticos, en ~ 25 nM concentración de miosina. </li></ol></li><li> Obtención de imágenes de la miosina caminando sobre la actina. <ol><li> Preparar buffer de imágenes (100 l) mediante la mezcla de 84 l M5-BSA (tampón M5 con 1 mg / ml de BSA), 1 l ATP (50 mM en ddH 2 O), 2 l de DTT (500 mM en ddH 2 O), 1 l CK (500 U / ml), 5 l CP (200 mM), 1 l PCD, 4 l PCA, 1 l de miosina-Qdot diluyó después otra 10 veces a 2,5 nM concentración de miosina, y 1 l BME. </li><li> Pipetear en buffer de imágenes 20 l para probar la cámara y se incuba durante 8-10 min. </li><li> Imagen de la muestra de TMicroscopio IRF a 30 ms de exposición. Adquirir un mínimo de 1.000 marcos. Ajuste el volumen de la miosina-Qdot en el Paso 3.3.1 si es necesario. </li></ol></li><li> Realizar el análisis de datos y encontrar el tamaño de paso de la miosina a pie. <ol><li> Abra el archivo de vídeo en ImageJ 17 y recortar el vídeo en torno a un punto móvil. Recortar un área lo suficientemente grande que el lugar nunca llega dentro de 20 píxeles del borde, y asegúrese de que no hay otros lugares en el video. Asegúrese de que este punto se mueve en una trayectoria lineal. </li><li> Realizar el seguimiento del punto a través del video para generar coordenadas xey a través del tiempo, en píxeles, mediante la aplicación de análisis de FIONA (Paso 2.5.3) para cada fotograma del vídeo. </li><li> Convertir píxeles a nanómetros, como se describe en la sección anterior. </li><li> Calcular el desplazamiento desde la posición inicial como una función del tiempo. </li><li> Ejecutar la prueba t en el desplazamiento para obtener los pasos de la miosina a pie. NOTA: El programa previsto t-test (step_t_test.zip) se codifica en IDL y en contraconsiste de 14 subprogramas de la carpeta. <ol><li> Abra todas las subrutinas en IDL y compilar todo dos veces. A continuación, ejecute mtltyanalysis_ttest.pro y elija un archivo de texto que contiene sólo los datos de distancia en una sola columna. Un archivo de salida de Excel se generará, que contiene los datos en bruto, la forma, y ​​el tamaño del paso. </li></ol></li><li> Elimine todos los valores cero de la columna de paso grande. Trazar la distribución de los tamaños de paso utilizando Origen o MATLAB. Montar un Gaussian al histograma. NOTA: los tamaños de paso de cero valores necesitan ser suprimido porque un paso de cero significa que no hay paso se toma de la trama anterior. El accesorio da un pico alrededor de 36 nm (como se muestra en la Figura 5). </li></ol></li></ol> 4. gruesa Preparación de muestras para FIONA <ol><li> Preparar los puntos cuánticos encapsulados en sol-gel. <ol><li> Mezclar 4,5 ml de TMOS, 1 ml ddH 2 O y 100 l de HCl (120 mM). Sonicar la mezcla en hielo durante 30 min en el limpiador ultrasónico specified en la Lista de Materiales (frecuencia = 40 kHz, calentador = off). Mezcle la solución cada 10 min. </li><li> Diluir 1,5 l Qdot605 en 1,5 ml de HEPES 50 mM (pH 7,2). Mezclar la solución con 1,5 ml de TMOS de la etapa anterior. </li><li> Vierta la mezcla en un plato con fondo de cristal. Selle el plato de fondo de vidrio con Parafilm y se almacena a 4 º C durante 1, 5 horas. </li><li> Añadir 2 ml de 1% en PBS BME al plato de la muestra y se incuba a temperatura ambiente durante 30 min antes de la formación de imágenes. </li></ol></li><li> Preparar la muestra córnea manchada con puntos cuánticos. NOTA: Conejo-ojos eran regalos de Dr. Marina Marjanovic. <ol><li> Se separa la córnea de los ojos y lo dividirá en 3 mm x 3 mm pedazos. </li><li> Diluir 1 l Qdot 605-estreptavidina en 1 ml de PBS. Incubar el tejido de la córnea con solución 1 nM a 4 qdots º C durante 1 hora. Lave el tejido con PBS. </li><li> Tome un portaobjetos de vidrio limpio y un cubreobjetos # 1.5. Ponga 4 capas de cinta de doble cara en el portaobjetos de vidrio a lo largo del lado más largo, unnd introducir otras 4 capas de cinta de doble cara paralela a la cinta anterior y dejar un canal de aproximadamente 1 cm en el medio. Coloque el tejido de la etapa anterior en el centro del canal, y se cubre con un cubreobjetos. </li><li> Presione suavemente en los lados del cubreobjetos para hacer que se pegue a las cintas. Moje el canal con 50 l de PBS antes de exponer. </li></ol></li><li> Puntos cuánticos de imagen en sol-gel y la córnea. <ol><li> Para FIONA imágenes en muestras gruesas, utilice un objetivo 60X de inmersión en agua con una distancia de trabajo de 0,27 mm, o un objetivo 60X de inmersión en agua con una distancia de trabajo de 0,28 mm. </li><li> Montar la muestra en el microscopio. Ajuste de la lente TIRF tal que alcanza el modo de epi-fluorescencia (es decir, el haz de láser sale del objetivo con un ángulo contra el cubreobjetos). Inserte una lente de aumento adicional (3.3X o 4,0X). </li><li> Mueva el plano focal del objetivo a una posición z deseada (por ejemplo,&gt; 200 m). Graba imágenes de inmóvilpuntos cuánticos en la muestra. </li></ol></li><li> Realizar análisis FIONA como se describe en la sección 2.5 de este protocolo. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

FIONA es una técnica para localizar la posición de un emisor fluorescente (fluoróforo orgánico o punto cuántico) con una precisión nanométrica y resolución temporal a 1 mseg 4 8. Cuando se recojan suficientes fotones, esta técnica permite determinar la posición de un emisor fluorescente mucha más precisión que el límite de difracción (~ 200 nm) y por lo tanto esta técnica abre un camino para observar lo que no se ha visto con el microscopio óptico convencional / tradicional 4 - 8. D...

Alrededor de 1882, Ernst Abbe encontró que la resolución de un microscopio de luz visible es de ~ λ / 2NA, o ~ 200 nm (donde λ es la longitud de onda y NA es la apertura numérica) 1,2. Por lo tanto cualquier objeto más pequeña que esta dimensión aparecería como un punto de difracción limitada en un microscopio óptico. Sin embargo, es posible determinar el centro de la mancha, es decir, la ubicación del objeto, con una precisión mucho más alta 3. Imágenes de fluorescencia con una precisión de un nanómetro (FIONA) es una técnica sencilla pero útil para la localización de fluoróforos individuales con precisión nanométrica en el plano xy 4. La precisión de la localización, σ μ (es decir, el error estándar de la media), depende del número total de fotones recogidos, <img alt="Ecuación 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" /> , Donde N es el recuento de fotones, s es la desviación estándar de la mancha fluorescente, a esel tamaño de píxel del detector de formación de imágenes, y b es la desviación estándar de los antecedentes 3,4. Para un fluoróforo que emite fotones ~ 10.000, Fiona puede alcanzar ~ 1 nm de precisión 4. FIONA se puede utilizar para determinar con precisión la posición de un emisor fijo, o uno móvil (suponiendo que las imágenes pueden tomarse lo suficientemente rápido). FIONA se puede aplicar secuencialmente a las tramas de la película y por lo tanto seguir el movimiento de la molécula única de 4 8. Reactivos fotoprotectores pueden ser necesarias para asegurar que la muestra no fotodegrada. Además, el objeto fluorescente en sí puede ser de cualquier tamaño, menor o mayor que la de difracción LIMIT- por ejemplo, puede consistir de un orgánulo (~ 1 m) con muchas proteínas fluorescentes dispersos en su membrana. Usando FIONA todavía puede producir un (nanómetros) promedio muy precisa de su centro de masa media. La gran mejora en la precisión de localización por FIONA permite resolver nanomemovimientos ter-escala en el tiempo. Esto ha empujado a la microscopía en la escala de longitud molecular 4 8. Desde su invención, se han desarrollado variantes de FIONA. Por ejemplo, las imágenes de campo claro con exactitud de un nanómetro (bFIONA) 9, una ligera variante de FIONA, imágenes y localiza objetos densos como melanosomas in vivo (objetos oscuros que contienen el pigmento melanina) con luz transmitida. Además, Fiona se ha empleado para resolver múltiples colorantes. Por ejemplo, una sola molécula de alta resolución de imagen con fotoblanqueo (camarones) 10,11 o de una sola molécula de alta resolución colocalización (SHREC) 12 se han desarrollado para resolver dos colorantes dentro de aproximadamente 10 nm. (Tenga en cuenta que esta es la resolución, es decir, con qué precisión se puede saber colorantes idénticos aparte.) Más recientemente, el análisis FIONA ha contribuido al proceso de localización de cierta super-resolución de microscopía óptica como reco estocásticomicroscopía nstruction (TORMENTA) 13 y 15 y la localización microscopía foto-activado (PALMA) 16, en el que fluoróforos oscuros temporales están entusiasmados, y luego la fluorescencia se localiza. Por repetidamente emocionante bastante baja densidad de tintes (menos de uno por difracción limitado punto), y luego recoger la fluorescencia, el análisis de cada uno de ellos por Fiona, se puede construir un mapa de alta resolución. La resolución está a continuación, sólo limitado por el número de fotones cada colorante pone a cabo, así como cosas como mantener estacionaria la muestra (incluyendo, por ejemplo, la platina del microscopio) durante la adquisición. En este trabajo, un resumen de la técnica FIONA y describa brevemente ejemplos de investigaciones que se han realizado utilizando FIONA se informó. En primer lugar, cómo configurar el equipo necesario para los experimentos de FIONA, es decir, un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), con detalles sobre la alineación de la óptica, se describe. Entonces, ¿cómollevar a cabo un sencillo experimento FIONA sobre la localización de las moléculas individuales de ADN-Cy3 inmovilizada utilizando protocolos apropiados, se ilustra. Después de eso, el uso de FIONA para medir el tamaño de paso de 36 nm de un solo miosina Va motor truncada marcada con un punto cuántico se presenta. La miosina Va es una proteína motora processive esencial que transporta carga celular mientras que a lo largo de los filamentos de actina translocación. Aquí una miosina Va construir truncado se utiliza para eliminar dominios irrelevantes para el tamaño del paso, y con una etiqueta FLAG añadió a la C-terminal para permitir la facilidad de etiquetado con puntos cuánticos funcionalizados con anticuerpos anti-FLAG. Este experimento se realiza en condiciones de baja ATP para ralentizar la miosina y permitir el uso de tiempos de exposición suficientemente largo para conseguir un buen recuento de fotones en cada fotograma. Cualquier marcador fluorescente suficientemente brillante podría ser sustituido en el siguiente protocolo. Por último, se informó reciente esfuerzo de extender la aplicación de FIONA para muestras gruesas. Como prueba de principio-, se empaparon los puntos cuánticosen sol-geles y las córneas de los ojos de conejo y luego fotografiada y localizada usando FIONA. Para imágenes, un objetivo de inmersión 60X agua con NA = 1,2 fue utilizado porque este objetivo tiene una distancia de trabajo de más de 100X objetivo de inmersión en aceite utilizado anteriormente. Para compensar la pérdida en la escala de reproducción en el objetivo, un objetivo extra-ampliación (3.3X o 4,0X) fue colocado en la trayectoria de emisiones. Además, epi-fluorescencia (no TIR) necesita microscopía para ser utilizado para acceder a regiones profundas en las muestras gruesas. Se demuestra que los puntos cuánticos empapados profundo de sol-gel y en las córneas de los ojos de conejo (Z&gt; 200 m) se pueden localizar con 2-3 nm precisión.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1083">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:211px;">Company</td>
			<td style="width:211px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:443px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Double-sided tape</td>
			<td style="width:211px;">3M</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>~ 75 um thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EMCCD camera</td>
			<td style="width:211px;">Andor Technology</td>
			<td style="width:211px;">DU-897E-CS0-#BV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Ultrasonic cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Branson</td>
			<td style="width:211px;">2510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescence filter set</td>
			<td style="width:211px;">Chroma</td>
			<td style="width:211px;">49016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Actin polymerization buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA02</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Biotin G-actin</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AB07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">G-actin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">AKL95</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">General actin buffer&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Cytoskeleton&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BSA01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser shutter (with driver)</td>
			<td style="width:211px;">Electro-Optical Products Corp.&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SH-10-MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">IDL</td>
			<td style="width:211px;">Exelis Visual Information Solutions</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Neutravidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:211px;">PI-31000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Coverslip</td>
			<td style="width:211px;">Fisherbrand&#160;</td>
			<td style="width:211px;">22X30-1.5</td>
			<td>0.16-0.19 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Microscope slide</td>
			<td style="width:211px;">Gold Seal Microslides&#160;</td>
			<td style="width:211px;">30103X1</td>
			<td>0.93-1.05 mm thick</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Plasma cleaner</td>
			<td style="width:211px;">Harrick Plasma</td>
			<td style="width:211px;">PDC-001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Glass bottom dish&#160;</td>
			<td style="width:211px;">In Vitro Scientific</td>
			<td style="width:211px;">D35-20-1.5-N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Cy3-DNA oligos</td>
			<td style="width:211px;">Integrated DNA Technologies</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>5&#39;-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3&#39;Bio</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent beads&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">T-7280</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot 605-streptavidin&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q10101MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot605&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q21301MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Qdot705</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22021MP&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">Qdot705 Antibody Conjugation Kit</td>
			<td style="width:211px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:211px;">Q22061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Matlab</td>
			<td style="width:211px;">MathWorks</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical table</td>
			<td style="width:211px;">Newport Corp</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td>RS4000 Series</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Nikon</td>
			<td style="width:211px;">Plan Apo VC 60x WI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">100X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">PlanApo 100X/1.45 Oil &#8734;/0.17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">60X Objective</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">UPlanApo 60X/1.20W</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Inverted microscope</td>
			<td style="width:211px;">Olympus</td>
			<td style="width:211px;">IX71/IX70/IX81</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Origin</td>
			<td style="width:211px;">OriginLab</td>
			<td style="width:211px;">--</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Anti-FLAG antibody</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">F7425-.2MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ATP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7699</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BME&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">63689-25ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A7906</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">BSA-biotin</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">A8549-10MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CK</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">C3755</td>
			<td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">CP</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P1937</td>
			<td>Phosphocreatine di(tris) salt</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">DTT</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">43815</td>
			<td>DL-Dithiothreitol</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">EGTA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">E3889</td>
			<td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N&#8242;,N&#8242;-tetraacetic acid</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">HEPES&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">H0887</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">KCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P9333</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">MgCl2</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">M1028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">NaCl</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCA</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">03930590</td>
			<td>Protocatechuic acid&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">PCD</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">P8279</td>
			<td>Protocatechuate-3,4-dioxygenase&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">TMOS</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">341436-25G</td>
			<td>Tetramethyl orthosilicate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Tris-HCl&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">93363</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Trolox</td>
			<td style="width:211px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:211px;">238813</td>
			<td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">1&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB1-E02, KM100</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">&#189;&#8221; diameter posts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TR4</td>
			<td>Quantity &#8805; 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">10x beam expander</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BE10M-A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BB2-E02, KM200</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:220px;">2&#8221; diameter f = 300 mm lens with mount</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LA1256-A, LMR2</td>
			<td>TIR lens</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Fluorescent alignment target&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">VRC2SM1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser safety goggles</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">LG3</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">ND filter(s)</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">FW1AND</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Optical beam profiler</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">BP209-VIS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Post-mounted iris diaphragm</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">ID25</td>
			<td>Quantity: 2</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Shearing interferometer</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">SI100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">XYZ translation stage, &#189;&#8221; travel&#160;</td>
			<td style="width:211px;">Thorlabs&#160;</td>
			<td style="width:211px;">T12XYZ</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:220px;">Laser</td>
			<td style="width:211px;">World Star Technologies&#160;</td>
			<td style="width:211px;">TECGL-30</td>
			<td>532 nm, 30 mW</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)

Imágenes de fluorescencia con una precisión de un nanómetro (FIONA) es una técnica sencilla pero útil para la localización de fluoróforos individuales con precisión nanométrica en el plano xy. Aquí un resumen de la técnica FIONA se informa y ejemplos de investigaciones que se han realizado utilizando FIONA se describen brevemente. En primer lugar, cómo configurar el equipo necesario para los experimentos de FIONA, es decir, un microscopio de fluorescencia de reflexión interna total (TIRFM), con detalles sobre la alineación de la óptica, se describe. Entonces cómo llevar a cabo un sencillo experimento FIONA en la localización de moléculas individuales de ADN-Cy3 inmovilizada usando protocolos apropiados, seguido por el uso de FIONA para medir el tamaño de paso de 36 nm de un solo miosina Va motor truncada marcada con un punto cuántico, se ilustra. Por último, se informó reciente esfuerzo para extender la aplicación de FIONA para muestras gruesas. Se muestra que, utilizando un objetivo de inmersión en agua y puntos cuánticos empapado profundamente en sol-geles oculares y córneas de conejo (&gt;200 micras), la localización de precisión de 2-3 nm se puede lograr.

Una configuración típica TIRFM tipo objetivo se muestra en la Figura 3. En primer lugar, la muestra Cy3-ADN inmovilizado en la superficie fue fotografiada. Una imagen típica se muestra en la Figura 4a. La imagen fue tomada con el tiempo de exposición de 0,5 segundos, con el aumento de EM = 50 y la sensibilidad CCD = 12,13 para la cámara. La propagación--función de punto (PSF) de una sola molécula de Cy3-DNA se muestra en la Figura 4b (desde el punto indicado por...

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Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Fluoróforos individuales pueden ser localizados con precisión nanométrica utilizando FIONA. Aquí se reporta un resumen de la técnica de FIONA, y la forma de llevar a cabo experimentos de FIONA se describe.

Imágenes de fluorescencia con un nanómetros Precisión (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

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Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

17.5K vistas.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  Fluoróforos individuales pueden ser localizados con precisión nanométrica utilizando FIONA. Aquí se reporta un resumen de la técnica de FIONA, y la forma de llevar a cabo experimentos de FIONA se describe. 

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Born Normalization for Fluorescence Optical Projection Tomography for Whole Heart Imaging

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental biology and gene expression studies. The technique renders biological sample optically transparent by first dehydrating them and then placing in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution). The technique renders biological samples optically transparent by first dehydrating them in graded ethanol solutions then placing them in a mixture of benzyl alcohol and benzyl benzoate in a 2:1 ratio (BABB or Murray s Clear solution) to clear. After the clearing process the scattering contribution in the sample can be greatly reduced and made almost negligible while the absorption contribution cannot be eliminated completely. When trying to reconstruct the fluorescence distribution within the sample under investigation, this contribution affects the reconstructions and leads, inevitably, to image artifacts and quantification errors.. While absorption could be reduced further with a permanence of weeks or months in the clearing media, this will lead to progressive loss of fluorescence and to an unrealistically long sample processing time. This is true when reconstructing both exogenous contrast agents (molecular contrast agents) as well as endogenous contrast (e.g. reconstructions of genetically expressed fluorescent proteins).

We suggest a Born normalized approach for Optical Projection Tomography (BnOPT) that accounts for the absorption properties of imaged samples to obtain accurate and quantitative fluorescence tomographic reconstructions. We use the proposed algorithm to reconstruct the fluorescence molecular probe distribution within small animal organs.

La normalización nació para tomografía de fluorescencia de proyección óptica de imágenes de todo corazón

Optical projection tomography is a three-dimensional imaging technique that has been recently introduced as an imaging tool primarily in developmental ...

Investigación

Biología

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscópica fluorescencia Tomografía por En vivo Imágenes de desarrollo Drosophila</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Visualizing Single-molecule DNA Replication with Fluorescence Microscopy

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA template is attached to a functionalized glass coverslip and replicated extensively after introduction of replication proteins and nucleotides (Figure 1). The growing product double-strand DNA (dsDNA) is extended with laminar flow and visualized by using an intercalating dye. Measuring the position of the growing DNA end in real time allows precise determination of replication rate (Figure 2). Furthermore, the length of completed DNA products reports on the processivity of replication. This experiment can be performed very easily and rapidly and requires only a fluorescence microscope with a reasonably sensitive camera.


This protocol demonstrates a simple single-molecule fluorescence microscopy technique for visualizing DNA replication by individual replisomes in real time.

Visualización de una sola molécula de ADN de replicación con microscopía de fluorescencia

We describe a simple fluorescence microscopy-based real-time method for observing DNA replication at the single-molecule level. A circular, forked DNA ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

Time-lapse de imágenes de mitosis después de la transfección de siRNA

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Cell Electrofusion Visualized with Fluorescence Microscopy

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves application of short high-voltage electric pulses to cells that are in close contact. Application of short, high-voltage electric pulses causes destabilization of cell plasma membranes. Destabilized membranes are more permeable for different molecules and also prone to fusion with any neighboring destabilized membranes. Electrofusion is thus a convenient method to achieve a non-specific fusion of very different cells in vitro. In order to obtain fusion, cell membranes, destabilized by electric field, must be in a close contact to allow merging of their lipid bilayers and consequently their cytoplasm. In this video, we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method. In this method, cells are allowed to attach only slightly to the surface of the well, so that medium can be exchanged and cells still preserve their spherical shape. Fusion visualization is assessed by pre-labeling of the cytoplasm of cells with different fluorescent cell tracker dyes; half of the cells are labeled with orange CMRA and the other half with green CMFDA. Fusion yield is determined as the number of dually fluorescent cells divided with the number of all cells multiplied by two.

In this video we demonstrate efficient electrofusion of cells in vitro by means of modified adherence method using electroporation and the subsequent detection of fused cells visualization with fluorescence microscopy.

Electrofusión de células visualiza con microscopía de fluorescencia

Cell electrofusion is a safe, non-viral and non-chemical method that can be used for preparing hybrid cells for human therapy. Electrofusion involves ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Rapid Analysis and Exploration of Fluorescence Microscopy Images

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized image analysis tools are available, most traditional image-analysis-based workflows have steep learning curves (for fine tuning of analysis parameters) and result in long turnaround times between imaging and analysis. In particular, cell segmentation, the process of identifying individual cells in an image, is a major bottleneck in this regard.
Here we present an alternate, cell-segmentation-free workflow based on PhenoRipper, an open-source software platform designed for the rapid analysis and exploration of microscopy images. The pipeline presented here is optimized for immunofluorescence microscopy images of cell cultures and requires minimal user intervention. Within half an hour, PhenoRipper can analyze data from a typical 96-well experiment and generate image profiles. Users can then visually explore their data, perform quality control on their experiment, ensure response to perturbations and check reproducibility of replicates. This facilitates a rapid feedback cycle between analysis and experiment, which is crucial during assay optimization. This protocol is useful not just as a first pass analysis for quality control, but also may be used as an end-to-end solution, especially for screening. The workflow described here scales to large data sets such as those generated by high-throughput screens, and has been shown to group experimental conditions by phenotype accurately over a wide range of biological systems. The PhenoBrowser interface provides an intuitive framework to explore the phenotypic space and relate image properties to biological annotations. Taken together, the protocol described here will lower the barriers to adopting quantitative analysis of image based screens.

Here we describe a workflow for rapidly analyzing and exploring collections of fluorescence microscopy images using PhenoRipper, a recently developed image-analysis platform.

Análisis rápido y exploración de microscopía de fluorescencia de Imágenes

Despite rapid advances in high-throughput microscopy, quantitative image-based assays still pose significant challenges. While a variety of specialized ...

Visualizing Stromule Frequency with Fluorescence Microscopy

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but whose functions remain mysterious. Alongside growing attention on the role of chloroplasts in coordinating plant responses to stress, interest in stromules and their relationship to chloroplast signaling dynamics has increased in recent years, aided by advances in fluorescence microscopy and protein fluorophores that allow for rapid, accurate visualization of stromule dynamics. Here, we provide detailed protocols to assay stromule frequency in the epidermal chloroplasts of Nicotiana benthamiana, an excellent model system for investigating chloroplast stromule biology. We also provide methods for visualizing chloroplast stromules in vitro by extracting chloroplasts from leaves. Finally, we outline sampling strategies and statistical approaches to analyze differences in stromule frequencies in response to stimuli, such as environmental stress, chemical treatments, or gene silencing. Researchers can use these protocols as a starting point to develop new methods for innovative experiments to explore how and why chloroplasts make stromules.

Protocols to investigate the dynamics of chloroplast stromules, the stroma-filled tubules that extend from the surface of chloroplasts, are described.

La visualización de frecuencia Stromule con microscopía de fluorescencia

Stromules, or "stroma-filled tubules", are narrow, tubular extensions from the surface of the chloroplast that are universally observed in plant cells but ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

Mezcla de cultivos primarios de murino intestino delgado previstos para el Estudio de Gut Hormone secreción y Imágenes de células vivas de células enteroendocrinas

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

Fluorescence Recovery after Photobleaching of Yellow Fluorescent Protein Tagged p62 in Aggresome-like Induced Structures

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical FRAP experiment, steady-state fluorescence is observed by repeated imaging with low-intensity laser light. Subsequently, the fluorescent molecules are rapidly and irreversibly impaired via brief exposure to high-intensity laser light. Information about protein mobility is obtained by monitoring the recovery of fluorescence. We used FRAP to determine the mobility of p62 in aggresome-like induced structures (ALIS) in murine macrophages after stimulation with lipopolysaccharide (LPS). Because many existing FRAP protocols are either incomplete or complex, our goal was to provide a comprehensive, practical, and straightforward step-by-step protocol for FRAP experiments with live cells. Here, we describe RAW264.7 macrophage transfection with yellow fluorescent protein-p62 (YFP-p62), induction of ALIS by exposing the cells to LPS, and a step-by-step method for collecting prebleach and postbleach FRAP images and data analysis. Finally, we discuss important factors to consider when conducting a FRAP experiment.

We describe a comprehensive and practical protocol for fluorescence recovery after photobleaching experiments with live cells. Although the protocol was used to measure the mobility of yellow fluorescent protein-tagged p62 in aggresome-like induced structures, it can be applied to a variety of microscopy systems and fluorescent proteins.

Recuperación de fluorescencia Tras Fotoblanqueo de amarillo fluorescente proteína Tagged p62 en estructuras Aggresome inducida por

Fluorescence recovery after photobleaching (FRAP)&#160;is a microscopy technique that can be used to quantify protein mobility in live cells. In a typical ...