La espectroscopia de RMN en las células ofrece un enfoque único para estudiar la estructura y la función de las proteínas directamente en las células vivas y para monitorear procesos biológicamente relevantes, como las interacciones proteína-ligando. Este biorreactor de RMN puede mantener un alto número de células humanas viables y metabólicamente activas durante varios días en el espectrómetro, lo que permite aplicaciones de RMN en la célula en tiempo real. Este método se puede aplicar a cualquier proteína intracelular soluble y de caída libre que experimente cambios conformacionales o químicos.
El etiquetado de isótopos amplía aún más la aplicabilidad del método. Para comenzar, ensamble la unidad de flujo utilizando un segundo tubo de RMN de la unidad de flujo, que luego se reemplazará por el que contiene células. Consulte las instrucciones de funcionamiento de la unidad de flujo para un montaje correcto.
Ajuste el baño de agua conectado al control de temperatura de la unidad de flujo a 37 grados centígrados y coloque la botella del depósito en el baño de agua. Conecte el tubo FEP de la botella del depósito a la bomba. Gire la válvula del biorreactor para evitar y prellene la bomba con medio.
Luego, gire la válvula del biorreactor para que fluya y llene previamente el biorreactor con el medio a 0.1 mililitros por minuto. Tome un matraz T75 de células T HEK 293 transfectadas de la incubadora de dióxido de carbono y retire el medio gastado. Agregue dos mililitros de tripsina EDTA a las células e incube durante cinco minutos a temperatura ambiente para separar las células.
Inactive la tripsina con 20 mililitros de DMEM completo y vuelva a suspender completamente las células mediante pipeteos hacia arriba y hacia abajo. Luego, transfiéralos en un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar las células a 800X G durante cinco minutos a temperatura ambiente y desechar el sobrenadante.
Transfiera el pellet celular a un tubo de microcentrífuga con tapa de 1,5 mililitros. Para incrustar las células en hilos de agarosa, derrita una alícuota de agarosa solidificada a 85 grados Celsius en un calentador de bloque, luego manténgala en solución a 37 grados Celsius en el calentador de bloque. Con una pipeta Pasteur, llene la parte inferior del tubo de RMN de la unidad de flujo con 60 a 70 microlitros de gel de agarosa al 1,5% y colóquelo sobre hielo para crear un tapón inferior de cinco milímetros de altura.
Caliente el pellet de la celda durante 15 a 20 segundos en el calentador de bloque y vuelva a suspender cuidadosamente las celdas en 450 microlitros de solución de agarosa, evitando la formación de burbujas. Aspire la suspensión de célula/agarosa en un tubo PEEK de cromatografía de 30 centímetros de largo de 0,75 milímetros de diámetro interior conectado a una jeringa de un mililitro. Deje que el tubo se enfríe a temperatura ambiente durante dos minutos.
Llene previamente el tubo de RMN de la unidad de flujo con 100 microlitros de PBS a temperatura ambiente. Fundir hilos de células incrustadas en agarosa en el tubo de RMN de la unidad de flujo empujando suavemente la jeringa. Retire el tubo de RMN vacío de la unidad de flujo y aumente el caudal a dos mililitros por minuto durante unos minutos para eliminar las burbujas de gas residuales en el tubo de entrada.
Ajuste el caudal a 0,2 mililitros por minuto e inserte el tubo de RMN que contiene las células empujándolo hacia arriba lenta pero constantemente. Suministrar el medio biorreactor a un caudal de 0,1 mililitros por minuto. Ajuste la temperatura en el espectrómetro de RMN a 310 Kelvin e inserte la unidad de flujo en el espectrómetro.
Una vez que el biorreactor se inserta en el espectrómetro de RMN, espere unos minutos para permitir el intercambio del medio. Ajuste la coincidencia y el ajuste del canal de protones, ajuste el imán y calcule la longitud del pulso duro de 90 grados del protón. Ajuste los niveles de potencia del protón en cada secuencia de pulsos de acuerdo con el pulso duro del protón.
Registre un primer espectro de RMN de protones zgesgp para registrar el contenido de la muestra en la homogeneidad del campo. Copie el zgesgp y el p3919gp o los experimentos SOFAST-HMQC al número deseado y póngalos en cola en la cola de adquisición. Inyecte una solución concentrada de la molécula externa en la botella de depósito medio perforando el tubo de silicona con una jeringa estéril de aguja larga.
Al final del experimento de RMN, reemplace el tubo que contiene las células con un tubo vacío y enjuague la unidad de flujo con agua. Para las células que expresan anhidrasa carbónica no etiquetada, procese los espectros p3919gp aplicando la función de ventana de llenado cero y de ampliación de línea exponencial. Para las células que expresan nitrógeno-15 marcado, superóxido dismutasa, procese los espectros SOFAST-HMQC aplicando la función de ventana de campana de llenado cero y signo cuadrado en ambas dimensiones.
En MATLAB, importe las regiones espectrales mediante el script personalizado Load_ascii_spectra. Ejecute el script Load_acqus para extraer las marcas de tiempo de los espectros 1D. Abra la GUI de MCR-ALS 2.0 ejecutando el script mcr_main y, en la pestaña Selección de datos, cargue la matriz de espectros.
Verifique los datos graficándolos. Evalúe el número de componentes, ya sea por descomposición de valores singulares o manualmente, y seleccione un método para la estimación inicial de los espectros puros. Se puede utilizar la detección de variables más pura o el análisis factorial evolutivo.
En la ventana Selección del conjunto de datos, seleccione Continuar. Establezca las restricciones para las concentraciones en la ventana Restricciones:modo de fila. Aplique una restricción de no negatividad, seleccionando fnnls como Implementación, y dos como el número de especies.
Luego, aplique una restricción de cierre, establezca la restricción en una, la condición de restricción de cierre como igual a y aplíquela a todas las especies. Establezca las restricciones para los espectros en la ventana Restricciones:modo columna. Aplicar una restricción de no negatividad, seleccionando fnnls como implementación, y dos como el número de especies.
En la ventana final, establezca 50 iteraciones y un criterio de convergencia de 0,01. Especifique los nombres de salida para concentraciones, espectros y desviación estándar. Haga clic en Continuar para ejecutar el ajuste MCR-ALS.
Las células en el biorreactor se pueden mantener vivas hasta por 72 horas, como lo confirma una prueba de azul de tripano. El biorreactor se utilizó para la monitorización en tiempo real de la unión de dos inhibidores, acetazolamida y metazolamida a la anhidrasa carbónica sobreexpresada en el citosol de las células T HEK 293. La presencia de señales de la proteína sobreexpresada y la homogeneidad del campo se evaluaron con el primer espectro de protones que esculpe la excitación.
En el caso de la anhidrasa carbónica, la unión intracelular de los dos inhibidores se monitorizó mediante la observación de señales de protones en la región entre 11 y 16 partes por millón del espectro WATERGATE, procedentes de las histidinas coordinadoras de zinc y otros residuos aromáticos. El enlace exitoso fue confirmado por la aparición de señales adicionales. MCR-ALS se utilizó para separar las señales de RMN que surgen de la anhidrasa carbónica libre y unida, y para proporcionar los perfiles de concentración relativa de las dos especies.
El biorreactor se aplicó para monitorear la formación de enlace disulfuro intramolecular de superóxido dismutasa unido a zinc promovido por ebselen, un imitador de glutatión peroxidasa. El análisis MCR-ALS en regiones seleccionadas del espectro 2D separó las señales que surgen de las dos especies y proporcionó sus perfiles de concentración relativa. Es importante insertar y retirar el tubo de RMN de la unidad de flujo de forma lenta y constante para evitar saltos de presión que puedan provocar la formación de burbujas.
El desarrollo de biorreactores de RMN ha allanado el camino para estudiar los procesos dependientes del tiempo de resolución atómica, como el trazado de la regulación redux y las interacciones fármaco/diana en las células vivas.
