Внутриклеточная ЯМР-спектроскопия предлагает уникальный подход к изучению структуры и функции белка непосредственно в живых клетках и мониторингу биологически значимых процессов, таких как белково-лигандные взаимодействия. Этот биореактор ЯМР может поддерживать высокое количество клеток человека жизнеспособными и метаболически активными в течение нескольких дней в спектрометре, что позволяет применять ЯМР в клетках в режиме реального времени. Этот метод может быть применен к любому растворимому, свободно кувыркающемуся внутриклеточному белку, претерпевающему конформационные или химические изменения.
Маркировка изотопов еще больше расширяет применимость метода. Для начала соберите проточный блок с помощью трубки ЯМР второго проточного блока, которая позже будет заменена на ту, которая содержит ячейки. Обратитесь к инструкциям по эксплуатации проточного блока для правильной сборки.
Установите водяную баню, подключенную к блоку измерения температуры проточной единицы, на 37 градусов Цельсия и поместите бутылку резервуара в водяную баню. Подключите трубку FEP баллона резервуара к насосу. Поверните клапан биореактора, чтобы обойти и предварительно заполнить насос средой.
Затем поверните клапан биореактора в поток и предварительно заполните биореактор средой со скоростью 0,1 миллилитра в минуту. Возьмите из инкубатора углекислого газа колбу T75 с трансфектированными HEK 293 Т-клетками и удалите отработанную среду. Добавьте два миллилитра трипсина ЭДТА в клетки и инкубируйте в течение пяти минут при комнатной температуре, чтобы отделить клетки.
Инактивируют трипсин 20 миллилитрами полного DMEM и тщательно повторно приостанавливают клетки путем пипетирования вверх и вниз. Затем переложите их в 50-миллилитровую центрифужную трубку. Центрифугируйте ячейки при 800X G в течение пяти минут при комнатной температуре и выбросьте супернатант.
Перенесите гранулу ячейки в 1,5-миллилитровую колпачковую микроцентрифужную трубку. Чтобы встроить ячейки в агарозные нити, расплавьте одну аликвоту затвердевшей агарозы при 85 градусах Цельсия в блок-нагревателе, затем храните ее в растворе при 37 градусах Цельсия в блок-нагревателе. С помощью пипетки Пастера заполните дно проточной трубки ЯМР от 60 до 70 микролитров 1,5% агарозного геля и поместите его на лед, чтобы создать нижнюю пробку высотой пять миллиметров.
Нагревайте ячейку гранулы в течение 15-20 секунд в блок-нагревателе и осторожно повторно подвешивайте ячейки в 450 микролитрах раствора агарозы, избегая образования пузырьков. Аспирировать клеточную/агарозную суспензию в 30-сантиметровую хроматографическую трубку PEEK внутреннего диаметра 0,75 миллиметра, соединенную со шприцем длиной в один миллилитр. Дайте трубке остыть при комнатной температуре в течение двух минут.
Предварительно заполните проточную трубку ЯМР 100 микролитрами PBS при комнатной температуре. Литые нити ячеек, встроенных в агарозу, в проточную установку ЯМР-трубки путем осторожного нажатия шприца. Извлеките пустую ЯМР-трубку из проточного блока и увеличьте расход до двух миллилитров в минуту в течение нескольких минут, чтобы удалить остаточные пузырьки газа во входной трубке.
Установите скорость потока на 0,2 миллилитра в минуту и вставьте ЯМР-трубку, содержащую ячейки, медленно, но неуклонно подталкивая ее вверх. Подавайте в биореактор среду со скоростью потока 0,1 миллилитра в минуту. Установите температуру в ЯМР-спектрометре на 310 Кельвинов и вставьте блок потока в спектрометр.
После того, как биореактор вставлен в ЯМР-спектрометр, подождите несколько минут, чтобы обеспечить обмен среды. Отрегулируйте согласование и настройку протонного канала, нажмите на магнит и рассчитайте длину жесткого импульса протона 90 градусов. Отрегулируйте уровни мощности протонов в каждой последовательности импульсов в соответствии с жестким импульсом протона.
Запишите первый протонный ЯМР-спектр zgesgp для записи содержания образца в однородности поля. Скопируйте эксперименты zgesgp и p3919gp или SOFAST-HMQC на нужное число и поставьте их в очередь в диспетчере очереди получения. Вводят концентрированный раствор внешней молекулы в бутылку со средним резервуаром, прокалывая силиконовую трубку стерильным длинноигольчатым шприцем.
В конце эксперимента С ЯМР замените трубку, содержащую ячейки, пустой трубкой и промойте проточный блок водой. Для клеток, экспрессирующих немаркированную карбоангидразу, обработайте спектры p3919gp, применяя функцию нулевого заполнения и экспоненциального окна расширения линии. Для клеток, экспрессирующих азот-15, меченую супероксиддисмутазой, обрабатывайте спектры SOFAST-HMQC, применяя функцию нулевого заполнения и колокольного окна с квадратным знаком в обоих измерениях.
В MATLAB импортируйте спектральные области с помощью пользовательского скрипта Load_ascii_spectra. Запустите сценарий Load_acqus, чтобы извлечь метки времени из 1D-спектров. Откройте графический интерфейс MCR-ALS 2.0, выполнив сценарий mcr_main, и на вкладке Выбор данных загрузите матрицу спектров.
Проверьте данные, построив их. Оцените количество компонентов либо путем разложения сингулярных значений, либо вручную, и выберите метод начальной оценки чистых спектров. Можно использовать либо чистейшее обнаружение переменных, либо эволюционирующий факторный анализ.
В окне Выбор набора данных нажмите кнопку Продолжить. Задайте ограничения для концентраций в окне Ограничения:режим строки. Примените ограничение без негатива, выбрав fnnls в качестве реализации и два в качестве количества видов.
Затем примените одно ограничение закрытия, установите ограничение на единицу, условие ограничения закрытия равно и примените ко всем видам. Задайте ограничения для спектров в окне Ограничения:режим столбца. Примените ограничение неотрицательности, выбрав fnnls в качестве реализации и два в качестве количества видов.
В последнем окне задайте 50 итераций и критерий сходимости 0,01. Укажите выходные имена для концентраций, спектров и стандартного отклонения. Нажмите «Продолжить», чтобы запустить фитинг MCR-ALS.
Клетки в биореакторе могут поддерживаться живыми до 72 часов, что подтверждается тестом трипан-синего цвета. Биореактор использовался для мониторинга в режиме реального времени связывания двух ингибиторов, ацетазоламида и метазоламида с карбоангидразой, сверхэкспрессированной в цитозоле ГЕК-293 Т-клеток. Наличие сигналов от сверхэкспрессированного белка и однородность поля оценивали с помощью первого возбуждающе-скульптурного протонного спектра.
В случае карбоангидразы внутриклеточное связывание двух ингибиторов контролировали путем наблюдения протонных сигналов в области между 11 и 16 частями на миллион спектра УОТЕРГЕЙТА, возникающими из цинк-координационных гистидинов и других ароматических остатков. Успешное связывание подтверждалось появлением дополнительных сигналов. MCR-ALS использовался для разделения сигналов ЯМР, возникающих из свободной и связанной карбоангидразы, и для обеспечения относительных профилей концентраций двух видов.
Биореактор применяли для мониторинга образования связанной с цинком внутримолекулярной дисульфидной связи, поддерживаемой эбселеном, имитацией глутатионпероксидазы. Анализ MCR-ALS на отдельных областях 2D-спектра разделил сигналы, исходящие от двух видов, и предоставил их относительные профили концентрации. Важно вставлять и снимать трубку ЯМР блока потока медленно и устойчиво, чтобы избежать скачков давления, которые могут вызвать образование пузырьков.
Разработка биореакторов ЯМР проложила путь к изучению процессов, зависящих от времени с атомным разрешением, таких как построение регуляции редукции и взаимодействия лекарств / мишеней в живых клетках.
