La metástasis es una de las principales causas de muertes relacionadas con el cáncer. Este fenómeno ocurre cuando las células cancerosas se separan del tumor primario, entran en la circulación sanguínea para finalmente llegar a un órgano objetivo distante. Una vez que estas células desprendidas entran en la sangre, las llamamos células tumorales secundarias.
Representan un material variable porque, por un lado, son los principales culpables de la formación de metástasis y, por otro lado, son más fáciles que las biopsias tumorales. De hecho, se pueden recolectar mediante una simple punción de sangre. A pesar del bajo número de estas células en la muestra de sangre, somos los primeros en establecer varias líneas celulares tumorales circulantes a partir de la sangre del paciente con mayor preocupación utilizando la condición controlada en 3D.
Esta línea celular se puede utilizar en cualquier línea celular comercial para experimentos de rutina. Por ejemplo, para el cribado genético de fármacos, a proteínas de interés, pero también para experimentos in vivo para probar la capacidad de iniciación tumoral y su potencial metastásico. CtC, líneas celulares tumorales circulantes, deben cultivarse en condiciones 3D en hipoxia.
Una vez que CTC ha formado esferas, podemos ponerlo en el medio y centrifugarlo durante cinco minutos a 300 RCF. Deseche el sobrenadante y agregue 500 microlitros de Accumax. Suspendemos uno e incubamos la solución 20 minutos a 37 grados.
Luego lave las esferas disociadas con PBS y peletice las células. Resusped el pellet con un DMEM/F12 recién suplementado y vea las células a la densidad de cinco celdas por microlitro en una nueva placa de 24 Low Attachment. Las esferas de ctc de centrífuga eliminan el sobrenadante y lavan el pellet dos veces con PBS.
A 500 microlitros de PFE mezclar bien e incubar el tubo en hielo durante 20 minutos. A continuación, centrífugo las esferas fijas y lave el pellet dos veces con PBS, eliminando el volumen máximo de PBS y añadiendo 20 microlitros de HistoGel formado. Llévalo a suspensión y haz una gota en el jarrón de cultivo, déjalo secar durante 10 minutos y desconéctalo con un bisturí.
Ahora puede procesar para cualquier deseado con el fin de CTC dirigido a una proteína deseada de interés. Recopile CTC y disocie las esferas con Accumax como se describió anteriormente. Elimine el Accumax y resuspenda el pellet con tres ml de tampón de bloqueo y transfiera la suspensión a través de un colador celular de 14 micrómetros para obtener una solución de celda única.
Cuente las células y envíelas a tubos y agregue un volumen de 200, 000 células, centrifugue los tubos y deseche el sobrenadante. De acuerdo con la hoja de datos de anticuerpos, agregue en un tubo, el volumen deseado del anticuerpo y en otro tubo su isotipo y continúe los pasos siguiendo las instrucciones del fabricante. El tubo restante no se etiquetará y el uso de un mercado de viabilidad se sugiere encarecidamente en este experimento.
En el citómetro, comience con el tubo no etiquetado para establecer el voltaje en el área marcada negativamente. Después de esto, coloque el tubo de isotipo. El isotipo serviría como control negativo para distinguir entre la señal positiva y la señal no específica.
Y termine el experimento con las células marcadas con el anticuerpo de interés donde debería ver un cambio en la puerta marcada positivamente, si se expresa la proteína de interés. Esto suspende CTC disociados en medio suplementado a la densidad de 200, 000 células por ml. En un accesorio Ultra Low 96, placa de pozo, selle el volumen de 50 microlitros e incube la placa 24 horas en hipoxia.
Al día siguiente, agregue 50 microlitros de diferente concentración del medicamento probado y agregue el mismo volumen de DMEM / F12 solo para determinar aún más la base de viabilidad celular e incubar la placa durante otras 48 horas. En el tercer día, reconstituya el agente y agregue 70 microlitros de la mezcla en cada pozo. Coloque la placa en un agitador orbital durante 20 minutos y luego mida la luminiscencia.
Este ensayo es una herramienta útil para probar un gran número de medicamentos con el fin de evaluar sus efectos sobre el crecimiento celular de CTC. En Eppendorf, las células de resuspend en 100 microlitros de PBS pellizcan la piel en la parte posterior del ratón e insertan la aguja debajo de la piel. Inyecte lentamente todo el volumen en el mismo lugar y controle el crecimiento del tumor cada dos días y sacrifique a los ratones si el tumor excede un tamaño de 1,5 centímetros cúbicos.
Antes de la cirugía, inyecte por vía subcutánea un analgésico, en el lado ventral dorsal del ratón, haga una pequeña incisión debajo de la 10ª costilla. Levante suavemente el bazo y colóquelo sobre una gasa estéril. Usando una jeringa de insulina, inyecte 50 microlitros de CTC resuspendidos en PBS y espere tres minutos sin quitar la aguja.
Ligar el vaso arterial de un lado y el vaso venal del otro lado. Luego retire el bazo cortando directamente por encima de las dos ligaduras. Cose el peritoneo abdominal y la piel y desinfecte bien la zona.
El objetivo de este experimento es probar la capacidad de los CTC derivados de pacientes con cáncer colorrectal para colonizar el hígado mediante la inducción de una previsión metastásica visible. El aislamiento y establecimiento de la línea celular tumoral clínica es una herramienta emergente tanto para estudios fundamentales como traslacionales. Por ejemplo, si tiene un gen de interés donde los estudios in vivo demostraron que este gen está involucrado en la migración y la capacidad de invasión de las líneas celulares de cáncer colorrectal, eliminar este gen en líneas celulares tumorales circulantes antes de la inyección en el bazo de ratones, dejar que colonicen el hígado podría ser una buena herramienta para confirmar su resultado in vivo.
Para los estudios traslacionales, nuestra perspectiva principal de aislar líneas celulares tumorales circulantes es utilizar este precioso material en medicina personalizada. A partir de las muestras de sangre del paciente, aislaríamos y amplificaríamos los CTC en cultivo durante dos o tres semanas con el fin de tener suficiente material para examinar el panel de medicamentos que está disponible y evaluar su citotoxicidad para finalmente atribuir
