Nuestro protocolo es significativo porque describe una generación de modelos de cultivo tumoral 3D a partir de células cancerosas primarias, y este modelo representa la biología tumoral del mundo real mejor que las líneas celulares. Este enfoque es aplicable a una variedad de tumores sólidos. También es rentable, ya que se puede realizar de principio a fin en un laboratorio típico de biología celular.
Los modelos tumorales 3D generados utilizando este enfoque apoyan la investigación sobre la sensibilidad y la resistencia de los tumores a las terapias contra el cáncer o una combinación de terapias. Este enfoque genera modelos 3D a partir de células cancerosas primarias. Por lo tanto, podría identificar qué terapia es probable que sea efectiva para un determinado paciente y, por lo tanto, ayudar a personalizar su tratamiento.
Demostrando el procedimiento estará Ella Itzhaki, una estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, tome un matraz T25 pequeño con un cultivo celular primario adherente de una sola célula y retire los medios de cultivo celular. Lave las células con PBS y agregue un mililitro de 1x Accutase durante tres minutos a 37 grados centígrados para preparar una suspensión unicelular de cultivos de células tumorales primarias adherentes de 75 a 100% de confluencia.
Neutralizar la solución Accutase añadiendo cinco mililitros de medio de cultivo celular. Aspirar las células con una pipeta serológica de 10 mililitros y depositarlas en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo a 800 g durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Retire el medio de cultivo celular y agregue ocho mililitros de medio de cultivo celular fresco sobre el pellet celular, luego mezcle suavemente. Para contar las células viables con un hemocitómetro, tome una alícuota de 50 microlitros de la suspensión celular y mézclela con 50 microlitros de azul de tripano. Luego cuente las celdas vivas y calcule el número total de celdas vivas en la suspensión.
A continuación, prepare el medio de cultivo 3D. Y después de calcular el número de células necesarias para el ensayo y el volumen total requerido, prepare la suspensión celular con el número deseado de células en 200 microlitros del medio de cultivo 3D. Mezclar suavemente con la pipeta para asegurar una distribución homogénea.
Transfiera la suspensión a un depósito de pipeteo y agregue 200 microlitros de la suspensión celular a cada pocillo de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja con una pipeta multicanal. Centrifugar la placa a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente para reforzar la agrupación de las células, mejorando así la agregación celular, e incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Después de centrifugar nuevamente a 300 g durante 10 minutos a temperatura ambiente, retire y deseche suavemente el 50% del medio, y agregue 100 microlitros de medio de cultivo 3D fresco para reemplazar la solución existente.
Repita este paso y vuelva a colocar la placa en la incubadora humidificada de 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Inspeccione las células bajo un microscopio cada uno o dos días para controlar la formación de esferoides. Mida el diámetro de los esferoides formados utilizando la herramienta de escala en el software de imágenes.
Y una vez que el diámetro del esferoide alcanza de 100 a 200 micrómetros, realice los experimentos de eficacia del medicamento. Para la recolección de esferoides, use una pipeta de 1, 000 microlitros para recolectar los esferoides de cada pocillo y depositarlos en un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar el tubo cónico a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente, y aspirar y desechar cuidadosamente el sobrenadante con una pipeta.
Agregue 0,5 mililitros del medio de cultivo celular y vuelva a suspender el pellet bien pero suavemente. Para realizar el conteo de esferoides, use una placa de 96 pocillos y dibuje un signo más en la parte inferior de un pozo para dividir el pozo en cuadrantes. Agregue 50 microlitros de la suspensión al pozo.
Y con una lente de objetivo 10x, cuente los esferoides manualmente bajo el microscopio. Cuente los esferoides en cada cuadrante y calcule el número total de esferoides en el pozo. Luego calcule la concentración de esferoides duplicando el recuento de esferoides contando el volumen y calcule el número total de esferoides en la suspensión.
En un tubo nuevo, prepare la suspensión esferoide a una concentración de 200 esferoides por 200 microlitros de medio de cultivo celular. Para cada tratamiento farmacológico, prepare el stock de esferoides en un tubo diferente. Calcule la cantidad total necesaria para cada medicamento por el número de pocillos necesarios para las repeticiones, y agregue el medicamento al tubo a la concentración final necesaria.
Transfiera 200 microlitros de la suspensión esferoide a los pocillos de una placa de 96 pocillos de fijación ultra baja e incube la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada con dióxido de carbono al 5%. Después de incubar los esferoides con el fármaco del estudio durante 24 a 72 horas, centrifugar la placa a 300 g durante cinco minutos a temperatura ambiente y retirar suavemente 170 microlitros del medio de cultivo celular, dejando 30 microlitros en el fondo del pozo. Prepare la solución MTT y agregue 70 microlitros de la solución a cada pocillo a un volumen final de 100 microlitros por pocillo.
La concentración final de MTT en el pozo será de 0,05 miligramos por 100 microlitros. Además, prepare pocillos en blanco con solución MTT sin células. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora humidificada de dióxido de carbono al 5% durante tres o cuatro horas hasta que se observe un cambio en el color de la solución en los pocillos.
Cuando se observe un cambio, agregue 100 microlitros de solución Stop a cada pocillo y mezcle suavemente el contenido de los pocillos sin crear burbujas. Lea la absorbancia de la placa en un lector ELISA de parámetros a una longitud de onda de 570 nanómetros y una longitud de onda de fondo de 630 a 690 nanómetros. Para calcular la viabilidad celular, calcule la señal específica para cada pozo.
Luego calcule el valor promedio de los pozos en blanco y reste este valor de cada pozo. Calcular el promedio de las señales específicas en los pocillos de control que contienen células que no fueron tratadas con el fármaco del estudio. Finalmente, calcule la viabilidad de las células en cada pocillo en relación con los pocillos con células no tratadas.
La formación de esferoides a partir de un cultivo primario de células de cáncer de colon a lo largo del tiempo por el número de células inicialmente sembradas se muestra aquí. A partir de esta figura, se puede ver que el número de esferoides generados depende del número de células inicialmente sembradas en cada pozo. Aquí se muestran los esferoides de las células primarias de cáncer de colon después de 10 días en cultivo con una siembra celular inicial de 2, 000 por pocillo.
Tras el cultivo prolongado de los esferoides de cáncer de colon, comenzaron a unirse entre sí y formaron grupos de esferoides y estructuras similares a uvas que impidieron un cultivo homogéneo y, por lo tanto, prohibieron el uso de los esferoides en los ensayos MTT. Los efectos de palbociclib, sunitinib y su combinación en los esferoides de las células tumorales primarias, incluyendo el cáncer de colon y de mama, se muestran aquí. Se realizó un ensayo MTT en esferoides derivados de células de cáncer de colon y mama.
Las señales MTT se normalizaron a valores de células tratadas con DMSO. Los valores representan las medias de cuatro a ocho réplicas. Los efectos de los diversos tratamientos sobre el crecimiento celular también se evaluaron microscópicamente en el día cero y después de tres días de tratamiento de los esferoides derivados del cáncer de colon y las células de cáncer de mama.
En esta figura se presentan los efectos de trastuzumab más vinorelbina y 5 fluorouracilo más cisplatino sobre los esferoides derivados del cáncer de mama a lo largo del tiempo. El cambio en el diámetro de los esferoides en relación con el día cero por la duración del tratamiento se muestra aquí. Cada grupo de tratamiento incluyó de cuatro a seis pocillos con un esferoide en cada pozo.
El cambio promedio se presenta aquí. Los esferoides son herramientas importantes para muchos estudios más allá de la respuesta al tratamiento contra el cáncer. Estos estudios abordan, por ejemplo, la administración de fármacos e incluso cuestiones básicas de biología, como las interacciones célula-célula.
Es fundamental iniciar un proceso de generación de esferoides con una suspensión de una sola célula. También es fundamental utilizar placas de fijación ultra bajas con un medio que contenga un 5% de métricas básicas de membrana.
