Con el objetivo de investigar la integridad de la barrera intestinal, desarrollamos un método para medir la integridad de la barrera intestinal en pequeños organoides intestinales de ratón. Por el contrario, nos referimos al cultivo celular monocapa usado, nuestro ensayo se basa en pequeños organoides intestinales tridimensionales. Adaptar un ensayo bidimensional a nuestro modelo fue esencial por su practicidad.
El ensayo se basa en organoides cultivados in vitro y su aplicación ayudará a definir inductores e inhibidores de la integridad de la barrera intestinal. La regulación de las proteínas de unión ajustada es una característica importante de todas las células epiteliales. Nuestro ensayo permite la función y el análisis de la integridad de las barreras epiteliales.
Para medir la integridad de la barrera de los organoides aislados del tejido intestinal del ratón, primero precuera todos los tubos de centrifugación que se utilizarán para almacenar los organoides durante el proceso de chapado con suficiente 0.1%BSA en PBS para cubrir todas las superficies plásticas. Retire inmediatamente la solución de BSA y coloque los tubos sobre hielo. A continuación, descongelar la solución de matriz celular y el medio de cultivo organoide en hielo y eliminar cuidadosamente el medio de cultivo de cada pozo de una placa de cultivo organoide de 48 pozos.
Lavar cada pozo con un mililitro de PBS frío antes de pipetear vigorosamente para disolver las matrices celulares. Cuando se hayan obtenido suspensiones celulares relativamente homogéneas, lave los organoides con PBS fresco dos veces por centrifugación y resuspend cada cultivo organoide en 40 microlitros de medio frío. Disociar las grandes estructuras organoides a través de una punta de pipeta de 10 microlitros cinco veces para recoger estructuras con un tamaño de 40 a 60 micrómetros y mezclar cada suspensión organoide con 40 microlitros de solución de matriz celular recién preparada.
Agregue cada suspensión de solución de matriz celular organoide en el centro de los pozos individuales de un cubreobjetos de ocho bien bien acondicionados y coloque la diapositiva en una bolsa de hielo durante cinco minutos. Al final de la incubación, coloque el portaobjetos en 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono durante 20 minutos para permitir la polimerización de la estructura de la matriz celular organoide antes de agregar 150 microlitros de medio de cultivo organoides a cada pozo para una incubación de 24 horas en la incubadora de cultivo celular. Al final de la incubación, tratar los pozos de control positivo con 10 nanogramos por mililitro de interferón murino recombinante gamma durante 48 horas.
Para realizar un ensayo de permeabilidad, transfiera el cubreobjetos con cámara a la cámara de incubación calentada de 37 grados Celsius de un microscopio confocal invertido y ajuste el dióxido de carbono de la cámara al 5% Bloquee las cubiertas firmemente en la etapa del microscopio y ajuste los ajustes de imagen del microscopio para visualizar los organoides en un pozo de la cámara. A continuación, agregue tres microlitros de 100 milivolilares Lucifer amarillos en 150 microlitros de medio a un pozo para una hora de incubación en la cámara del microscopio. Al final de la incubación, ajuste el enfoque para visualizar el lumen del organoide de referencia y defina la energía láser necesaria para la excitación amarilla de Lucifer y la sensibilidad de detección respectiva del instrumento para imaginar la señal amarilla Lucifer en 30 a 40% del rango dinámico disponible del instrumento.
Alternativamente, la intensidad de la señal se puede modificar cambiando el tiempo de exposición. Para encontrar las posiciones de unos 10 organoides con una estructura esférica cerca de la superficie del cubreobjetos por interferencia diferencial contrastan la imagen en vivo, capturando organoides con diámetros comparables y centrándose en la rebanada central de los organoides para tomar imágenes de los lúmenes. Registre el contraste de interferencia diferencial y la fluorescencia amarilla Lucifer de cada posición para documentar la forma y la autofluorescencia de cada organoide.
Cuando todos los organoides hayan sido imageados, agregue 150 microlitros de medio, incluyendo Lucifer amarillo, a los pozos de tratamiento amarillo Lucifer e imagine todos los pozos cada cinco minutos durante 70 minutos. Al final de la sesión de imágenes, agregue cuatro microlitros de EGTA recién preparados a 100 microlitros de medio. Añadir el EGTA diluido a los pozos apropiados.
Luego, registre la fluorescencia de los organoides en cada pozo cada cinco minutos durante 30 minutos. Asegúrese de practicar el manejo y el cultivo o organoides de antemano, ya que la viabilidad celular y la integridad son un requisito previo para el éxito del ensayo. En este experimento representativo, después de 70 minutos de tratamiento con Lucifer intraluminal amarillo Lucifer fluorescence amarillo sólo fue visible en organoides de animales de tipo salvaje tratados con interferón gamma.
Ni los controles no estimulados, ni los organoides derivados de los animales noqueados del receptor gamma de interferón-2 mostraron fluorescencia amarilla intraluminal Lucifer al final del período de tratamiento. La adición de EGTA causó una descomposición inespecífica de la integridad de la barrera intestinal al secuestrar cofactores de unión apretados, lo que resultó en la toma y expresión de color amarillo Lucifer en todos los organoides independientemente de las condiciones de origen o tratamiento. Los valores de intensidad relativa para el nivel de fluorescencia amarilla Lucifer dentro del lumen organoide y fuera de cada organoide también se pueden cuantificar.
Asegúrese de seleccionar organoides con un tamaño comparable alrededor de la configuración y seleccionar el eje de ajuste para que pueda imaginar el lumen central del organoide. Además de utilizar sustancias que inducen la ruptura de la barrera intestinal, también podemos investigar estrategias para la inhibición de la destrucción de la barrera intestinal. Como esta metodología se basa en células primarias de un solo animal, se puede utilizar para muchos ensayos, reduciendo el número de animales necesarios para cada experimento.
