Este protocolo describe el primer modelo apical-out in-a-dish y es una mejora crítica sobre los modelos basales laterales enteroides en una placa al establecer el modelado in vitro de posibles terapias destinadas a la administración oral. Este método permite el acceso a la superficie apical de los enteroides. Los compuestos se pueden agregar a los medios celulares y los compuestos se absorben apicalmente como lo harían in vivo.
Los investigadores interesados en establecer un sistema in vitro de inflamación intestinal para probar posibles terapias orales pueden encontrar esta técnica especialmente útil. El tejido procedente de diferentes edades y especies puede requerir una mayor estandarización. Por lo tanto, los pacientes pueden ser necesarios al establecer tiempos de inversión de polaridad.
Para invertir la polaridad de los enteroides 3D, aspira medios de cada pocillo de una placa de 24 pocillos de enteroides basolaterales 3D establecidos. Agregue 500 microlitros de cinco milimolares helados, EDTA o PBS a cada pocillo de una placa de 24 pocillos e interrumpa mecánicamente suavemente el extracto de la membrana basal o la cúpula de la matriz extracelular pipeteando hacia arriba y hacia abajo de cinco a seis veces con una pipeta P 200. Transfiera el contenido de cuatro pocillos a un tubo cronometrado de 15 mililitros.
Luego agregue ocho mililitros de EDTA helado que cortan PBS al tubo. Transfiera los 20 pozos restantes de la misma manera. Incubar los tubos a cuatro grados centígrados durante una hora en una plataforma giratoria o agitador a 330 RPM.
Después de la incubación, centrifugar los tubos y desechar el sobrenadante de cada tubo. Combine y lave los gránulos con cinco mililitros de DMEM F12. Luego centrifugar la suspensión celular y retirar el sobrenadante antes de añadir 12 mililitros de medio libre de antibióticos al tubo asegurándose de que los gránulos celulares se resuspendan.
Pipepet 500 microlitros de la suspensión enteroide en cada pocillo de una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos. Incubar la placa a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono durante dos a cinco días o hasta que los enteroides hayan invertido la polaridad. En el primer día de abstención, transfiera el contenido de cuatro pocillos de una placa de 24 pocillos a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Repita para todos los pozos deseados con cada tratamiento en un tubo separado. Centrifugar los tubos y resuspender el pellet en 300 microlitros de fijador de aldehído al 4% a temperatura ambiente. Después de 30 minutos lavar los pellets con 500 microlitros de PBS.
Agregue 500 microlitros de 0.1% Triton X 100 a los tubos. Incubar los tubos durante una hora a temperatura ambiente. Luego, coloque los tubos en un rotador o agitador a 200 RPM durante 15 minutos a dos a ocho grados centígrados.
Después de la última incubación, agregue 500 microlitros de 10% NDS en PBS T e incube a temperatura ambiente durante 45 minutos. Durante la incubación, prepare la solución primaria de anticuerpos. Al día siguiente, agregue de 250 a 500 microlitros PBS T a los tubos dependiendo del tamaño del pellet, y colóquelos en el rotador o agitador a 200 RPM durante una hora a dos a ocho grados centígrados.
Agregue 200 microlitros de la solución de anticuerpos secundarios e incube los tubos a dos a ocho grados centígrados en la oscuridad. Al día siguiente, proceda a montar enteroides apicales teñidos girando los tubos y retirando 100 microlitros de sobrenadante. Resuspender las células en los 100 microlitros restantes de sobrenadante y transferir la suspensión celular a tubos de 500 microlitros.
Centrifugar los tubos en una mini centrífuga durante 20 segundos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en 100 microlitros de tinción de ácido nucleico rojo lejano a temperatura ambiente. Después de 20 minutos de incubación, centrifugar las células y resuspender los gránulos en 100 microlitros de PBS.
Después del segundo lavado y centrifugación, retire 70 microlitros del sobrenadante y vuelva a suspender los gránulos en el volumen restante de PBS. Luego transfiera la suspensión celular a un cubreobjetos etiquetado de 24 por 60 milímetros. Aplique 75 microlitros de montante directamente sobre la muestra y elimine cualquier burbuja con una punta de pipeta.
Después de curar durante la noche en la oscuridad, aplique una capa delgada de glicerol a los resbalones de la cubierta, luego monte los deslizamientos de la cubierta en el portaobjetos de vidrio y presiónelo suavemente en su lugar. Toque para eliminar cualquier burbuja entre la cubierta y la corredera. Permita que la cubierta se fije a temperatura ambiente en la oscuridad durante dos horas antes de obtener imágenes de los enteroides con un aumento de 20 veces con un microscopio confocal.
Para los tratamientos enteroides, establecer una enterocolitis necrotizante apical en un modelo de plato durante 24 horas como se describe en el manuscrito de texto. Antes de realizar el ensayo, retire 100 microlitros de medios de cada pocillo dejando los 400 microlitros restantes. Agregue 400 microlitros de reactivo de ensayo de viabilidad celular a cada pocillo.
Mezcle vigorosamente el contenido en un agitador de placas durante cinco minutos a 200 RPM para inducir la lisis celular. A continuación, transfiera 200 microlitros a un solo pocillo de una placa de fondo transparente de 96 pozos. Repita para los 600 microlitros restantes creando cuatro réplicas técnicas por pozo.
Utilizando un lector de placas capaz de luminiscencia, registre los valores a 0,25 milisegundos de integración y compare los valores relativos entre los tratamientos. La tinción de inmunofluorescencia representativa del control confirmó la localización apical de los núcleos hacia el lumen y la detección de villano en el borde exterior del epitelio. En comparación con el control, la exposición a lipopolisacáridos, necrosis tumoral alfa o hipoxia sola no indujo cambios manifiestos en la morfología de las células macroscópicas E-cadherina o localización de villanos o intensidad fluorescente.
El tratamiento con lipopolisacárido o necrosis tumoral alfa en combinación con hipoxia interrumpió la arquitectura epitelial y demostró una pérdida significativa de la unión de adherencia y la expresión de proteínas del borde en cepillo revelada por la pérdida de audición ECA y tinción de villanos. La viabilidad celular apical se determinó en condiciones normóxicas o hipóxicas. En condiciones normóxicas en comparación con el lipopolisacárido control o la necrosis tumoral alfa no afectó significativamente la viabilidad celular de los enteroides.
Sin embargo, se observaron reducciones significativas en la viabilidad en lipopolisacáridos o necrosis tumoral alfa en combinación con hipoxia en comparación con hipoxia sola. Mientras se establece el modelo apical en un plato. Recuerde mantener el EDTA en la suspensión celular helada.
Esto mejorará la inversión de la polaridad y asegurará que toda la ECM se licúe y elimine correctamente. Otras aplicaciones posteriores como QPCR, RNA-seq, western blot o evaluaciones funcionales de la permeabilidad de la barrera se pueden realizar más para caracterizar la respuesta a la señalización inflamatoria en hipoxia.
