Este protocolo muestra cómo utilizar organoides intestinales derivados de biopsia y tecnología de órgano en un chip para generar un chip intestinal fisiológicamente relevante que luego se puede utilizar para predecir la farmacocinética y la interacción fármaco-fármaco y para estudiar la disfunción de la barrera epitelial intestinal. La unión de organoides en la tecnología de órgano en un chip nos permite reproducir la complejidad del epitelio intestinal. Además, permite un mayor control experimental de las señales mecánicas, la distribución del flujo y los gradientes bioquímicos.
Este método emula la compleja fisiología del intestino humano, dando una mayor comprensión de las bases celulares y moleculares de las funciones intestinales normales y patológicas. Esto ayuda a predecir mejor la farmacocinética y la farmacodinámica y los posibles candidatos a fármacos para prevenir el daño inflamatorio. La siembra es un paso crítico en el protocolo.
La fragmentación excesiva o la densidad de siembra inexacta de los fragmentos organoides intestinales pueden comprometer el desarrollo y la diferenciación de la barrera epitelial. Para comenzar, aspire el medio del cultivo de organoides estáticos. Recupere los medios de suficientes pozos para lograr una densidad de siembra final de ocho millones de células por mililitro.
Agregue 500 microlitros de solución de disociación de BMM helada a cada pocillo y conecte el BMM solubilizado de la superficie del pozo. Recoja la suspensión en un tubo de unión a proteínas bajas en 15 mililitros y colóquela en hielo. Agite suavemente el tubo cada 15 minutos durante una hora.
Centrifugar a 300 veces G durante cinco minutos a cuatro grados centígrados para obtener un pellet de organoide. Si se observa una capa de gel transparente sobre el pellet, aspire la solución del tubo. Vuelva a suspender el pellet y agregue un volumen igual de solución de disociación BMM.
Incubar en hielo durante 10 minutos y centrifugar. Repita hasta que no haya residuos de BMM solubilizados. Luego deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet en dos mililitros de solución de digestión organoide.
Incubar el tubo a 37 grados centígrados durante uno a tres minutos y añadir ocho mililitros de DMEM F12 avanzado para detener la reacción enzimática. Centrifugar y resuspender el pellet en medio de crecimiento organoide completo para lograr ocho millones de células por mililitro. Alícuota 360 microlitros en tubos estériles de 1,5 mililitros de baja unión proteica.
A continuación, retire el medio del canal superior de los chips recubiertos y agregue 30 microlitros de la suspensión celular. Incubar los chips a 37 grados centígrados durante la noche para adherir los fragmentos de organoides a la membrana. Agregue tres mililitros de medio de crecimiento organoide completo preequilibrado al depósito de entrada superior y tres mililitros de medio de crecimiento de células endoteliales preequilibradas en el depósito de entrada inferior.
Agregue 300 microlitros del mismo medio en los respectivos depósitos de salida superior e inferior. Transfiera la bandeja que lleva los módulos portátiles al módulo de cultivo. En el módulo de cultivo, ejecute repetidamente el ciclo primario hasta que se formen gotas suficientes para conectar correctamente los chips.
A continuación, deslice el portador de chip en el módulo portátil. Luego comience el ciclo de regulación de dos horas de duración para presurizar los medios de cultivo en el módulo portátil y el chip, después de lo cual se reanudarán las condiciones programadas. A continuación, cambie la configuración de ampliación e inicie el módulo de cultivo.
Después de 24 horas, repita el ciclo con 10% de estiramiento y la misma frecuencia. Para preparar los medios de dosificación o el control del vehículo, diluir las soluciones madre inductoras del CYP o DMSO en un medio de crecimiento organoide completo y un medio de crecimiento de células endoteliales. Pausa el módulo de cultivo y lleva las bandejas al gabinete de bioseguridad.
Reemplace el medio en todos los depósitos de entrada y salida con dos mililitros de medios dosificadores con inductores o control del vehículo. Devuelva los módulos portátiles al módulo de cultivo y reinicie el flujo a 30 microlitros por hora. Reemplace el medio con una solución inductora recién preparada cada 24 horas y continúe el cultivo durante 48 a 72 horas.
Luego lleve las bandejas al gabinete de bioseguridad y aspire el medio dosificador de todos los depósitos. Lave y reemplace el depósito de entrada superior con un medio DMEM F12 avanzado y el depósito inferior con un medio de crecimiento de células endoteliales. Reemplace el medio de lavado con un mililitro de solución de sustrato de sonda.
Perfundir las virutas a un alto caudal de 1.000 microlitros por hora durante cinco minutos y aspirar los depósitos de salida superior e inferior. Devuelva los chips al módulo de cultivo e incube durante una hora bajo un flujo constante de 300 microlitros por hora. Después de una hora de tratamiento, detenga el flujo y lleve las bandejas al gabinete de bioseguridad.
Recoja 100 microlitros de efluente del depósito de salida superior y agréguelo a un tubo que contenga 200 microlitros de solución de parada. Coloque los tubos inmediatamente sobre hielo seco y almacene las muestras a menos 80 grados centígrados. Lave ambos canales con 200 microlitros de DPBS estéril.
A continuación, bloquee la salida del canal inferior con una punta de pipeta de filtro de 200 microlitros. Perfundir 50 microlitros de la solución de disociación a través del canal inferior e incubar durante dos minutos a temperatura ambiente. Asegurar el desprendimiento completo de las células endoteliales y eliminar la solución de disociación del canal mediante pipeteo.
Repita el lavado. A continuación, bloquee la salida del canal superior y perfunda 75 microlitros de tampón de lisis de proteínas. Deje la punta de la pipeta insertada e incubar durante cinco minutos a temperatura ambiente.
Recoja los lisados celulares en un tubo de 1,5 mililitros pipeteando de cinco a 10 veces. Repita la perfusión y la recolección para obtener el desprendimiento completo de las células y almacene los lisados a menos 80 grados centígrados hasta el análisis. Para la lisis de ARN, siga el mismo procedimiento mientras usa 150 microlitros de tampón de lisis de ARN.
Primero, prepare una solución dosificadora de interferón gamma diluyendo las soluciones madre en un medio de crecimiento de células endoteliales desgasificadas. En el gabinete de bioseguridad, retire el medio de los depósitos de entrada del canal inferior y reemplácelo con tres mililitros de la solución dosificadora diariamente. Luego coloque las bandejas en el módulo de cultivo y perfunda las virutas a un alto caudal de 1, 000 microlitros por hora durante cinco minutos.
Cambie el caudal a 60 microlitros por hora y continúe el cultivo fluídico. Agregue 100 microlitros de DPBS por pocillo en una placa de pared negra de 96 pocillos. Usando una pipeta multicanal, agregue 50 microlitros del efluente de todos los reservorios a los pozos respectivos.
Para preparar una curva estándar, realice una dilución triple del medio que contiene 100 microgramos por mililitro de tres kilodalton dextrano en cascada azul en DPBS. Luego realice delirios seriados utilizando una dilución triple del medio de crecimiento de células endoteliales en DPBS. Las características morfológicas distintivas del duodeno y los chips de colon se destacaron por la presencia de las formaciones similares a vellosidades en el chip del duodeno que representan la arquitectura del intestino delgado.
En el chip duodeno expuesto a los inductores del citocromo P450 rifampicina y vitamina D3, hubo una expresión génica de ARNm elevada para la enzima metabolizadora del fármaco citocromo P450 3A4 y una mayor actividad catalítica de la enzima citocromo P450, lo que indica respuestas de inducción apropiadas en los tres donantes de organoides. Al tratar la monocapa epitelial del chip de colon con interferón gamma, se observó una morfología celular comprometida y pérdida del epitelio columnar. Además, el tratamiento con interferón gamma condujo a un aumento de la señal citoplasmática de las proteínas de unión estrecha y adherente en comparación con el control del vehículo, mostrando el desplazamiento de los marcadores de unión estrecha ZO-1 y claudina 4 y la internalización de la ocludina y la E-cadherina.
Se observó un aumento significativo en la permeabilidad paracelular epitelial después de 48 horas de estimulación con interferón gamma en chips de colon. Del mismo modo, el interferón gamma induce la activación de la apoptosis indicada por el aumento en el contenido intracelular de la Caspasa 3 escindida. El interferón gamma indujo una secreción polarizada de moléculas proinflamatorias en el chip del colon, como lo demuestra la secreción basolateral de VCAM-1 e interleucina-6 y la secreción apical de ICAM-1 y la proteína amiloide sérica A.
Después del establecimiento exitoso del chip intestinal, podemos estudiar la absorción, el transporte y el metabolismo intestinal, los niveles de nutrientes y la secreción de hormonas intestinales, las interacciones de patógenos microbianos del huésped, la seguridad y eficacia de los medicamentos, los mecanismos de enfermedad específicos del paciente y las respuestas a las terapias.
