El método de corte pulmonar de precisión preservará la estructura y las orientaciones espaciales en tres dimensiones sin sesgo regional y puede servir como un modelo sustituto vivo para las mediciones de contractilidad de los vasos y las vías respiratorias. En combinación con imágenes de lapso de tiempo, Western blot y análisis de ARN, las rodajas pulmonares cortadas con precisión contribuyen a la comprensión integral de las cascadas de señalización que subyacen a una amplia variedad de trastornos y conducen a una mejor comprensión de la fisiopatología en las enfermedades vasculares pulmonares. Para comenzar, coloque el ratón adulto sacrificado en posición supina y asegúrelo en su lugar pegando las patas y la nariz a la mesa con cinta adhesiva.
Rocíe la superficie ventral del ratón con 70% de etanol. Use forrceps para levantar la piel abdominal del ratón en la ubicación de la vejiga y tijeras quirúrgicas para cortar en la línea media, moviéndose superiormente a la región cervical para exponer la tráquea. Luego use pinzas para levantar la capa de fascia subyacente y use tijeras quirúrgicas para exponer los órganos viscerales y el compartimiento mediastínico, nuevamente cortando de manera inferior a superior.
Corte el esternón en la línea media para exponer el corazón y el pulmón. Diseccionar el diafragma cuidadosamente desde el hígado y el compartimiento abdominal. Localice la vena cava inferior debajo de los intestinos y córtela.
Después de localizar el ventrículo derecho, use una aguja de mariposa de calibre 25 a 30 para inyectar 0.5 mililitros de heparina fraccionada al 1% en el ventrículo derecho y enjuáguelo lenta pero constantemente con 10 a 15 milímetros de PBS. Después de localizar la laringe, use pinzas de punta roma para diseccionar la fascia y el tejido circundantes, luego coloque la sutura quirúrgica debajo de la tráquea y ate libremente un nudo quirúrgico. Coloque un pequeño orificio en la tráquea superior a la cuerda y cannulate con una aguja roma de calibre 20.
Apriete la sutura alrededor de la aguja y la tráquea con un nudo quirúrgico. Luego inyecte de 2.5 a 4 mililitros de agarosa en la tráquea y controle la inflación del pulmón. Después de la inyección de agarosa, vierta PBS frío sobre el pulmón para solidificar la agarosa.
Luego corte la tráquea superior a la sutura quirúrgica y diseccione el pulmón y el corazón del mediastino eliminando cualquier adherencia y fascia. Después de la solidificación, coloque el tejido en DMEM en una placa de Petri sobre hielo e inmediatamente proceda a cortar un lóbulo con una máquina de vibratomo. Para preparar las rodajas pulmonares, conecte la muestra a la plataforma con superpegamento, manteniendo el lado medial hacia arriba.
A continuación, llene el recipiente de muestra con PBS. Llene el recipiente con hielo para mantener el PBS circundante y la muestra fría. Encienda el vibratomo.
Ajuste el grosor a 300 micrómetros, la frecuencia a 100 hercios, la amplitud a 0,6 milímetros y la velocidad a cinco micrómetros por segundo. Con una llave Allen, gire el soporte de la cuchilla en la posición segura y abra las mandíbulas para insertar una cuchilla. Luego apriete las mandíbulas con una llave Allen.
Coloque la muestra en la caja, asegurándose de que esté sumergida en PBS. Deslice la caja hacia arriba en la posición correcta y asegúrese de que sea segura. Gire el soporte de la cuchilla en la posición adecuada para cortar.
Lleve la cuchilla del vibratomo hasta el borde del bloque y baje manualmente la cuchilla hasta que esté uniforme con la parte superior de la muestra. Confirme la configuración y ejecute el vibratome. Después de cortar las rodajas frescas, retire las muestras del PBS y colóquelas en una placa de Petri estéril con 10 mililitros de DMEM que contengan un antibiótico antimicótico de una sola vez.
Después de colocar todas las rodajas en una placa de Petri, retraiga la cuchilla por completo y use la llave Allen para elevar la cuchilla a una posición segura. Almacene las muestras en DMEM a 37 grados centígrados. Y coloque una rebanada de vibratomo en un portaobjetos de microscopio.
Use una toallita de limpieza para eliminar el exceso de medio. Coloque la muestra en la microscopía de contraste de fase y use un aumento de 10 a 20X para identificar un vaso. Luego agregue 500 microlitros de vasoconstrictores, como cloruro de potasio 60 milimolar o una endotelina-1 micromolar para sumergir completamente el portaobjetos.
Observe y capture el video grabando durante 30 a 60 segundos. Antes de comenzar el experimento, llene una pequeña caja de espuma de poliestireno con un litro de nitrógeno líquido y coloque dos tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitros en el recipiente con nitrógeno líquido. Coloque de cuatro a cinco rodajas frescas de vibratomo en un tazón de mortero.
Vierta de 5 a 10 mililitros de nitrógeno líquido sobre las rodajas y use rápidamente el mortero para moler las rodajas en polvo antes de que el nitrógeno líquido se evapore. Use una cuchara de laboratorio de acero preenfriada para recoger el polvo en los dos tubos de microcentrífuga refrigerados y lisar el polvo agregando 500 microlitros de reactivo de extracción de ARN para el aislamiento de ARN o 500 microlitros de tampón RIPA para la lisis de proteínas. En el experimento de viabilidad representativa, se detectó el cambio de color de las rodajas PCLS del día cero al uno y del día nueve al 10.
La solución fue inicialmente azul y se volvió rosa de la noche a la mañana, demostrando viabilidad. El cambio de color generalmente ocurre dentro de una a cuatro horas, pero puede ser necesario un tiempo más largo. La diferencia diaria entre la absorbancia a longitudes de onda de 562 y 613 nanómetros para el tejido preparado con vibratomo se muestra aquí.
La constricción de la vasculatura en un tejido pulmonar preparado con vibratomo utilizando endotelina-1 y cloruro de potasio se puede visualizar aquí. La preservación del etiquetado de tdTomato en las células una semana después de la inyección de tamoxifeno se demuestra en estas rodajas pulmonares. Es muy importante realizar bien el paso de limpieza e inflado pulmonar para eliminar toda la sangre de la circulación antes de experimentos adicionales e imágenes.
Además de las enfermedades vasculares, el PCLS se puede aplicar para estudiar la fisobiología de las enfermedades relacionadas con las vías respiratorias, y se puede probar más a fondo en tejidos pulmonares humanos en escenarios clínicamente relevantes.
