El mal funcionamiento cardiovascular es la principal causa de muerte en todo el mundo. El modelo de corazón aislado que presentamos aquí puede servir como una ventana experimental en la dinámica cardíaca humana. Este enfoque combina un estudio clásico de electrofisiología con el mapeo óptico simultáneo de voltaje transmembrana y calcio intercelular para evaluar el estado del corazón.
Esta metodología se puede aplicar a estudios de modelado de enfermedades, farmacología y toxicología. Por ejemplo, una de nuestras áreas de enfoque es caracterizar los efectos de los tamañores de vidrio en la electrofisiología cardíaca. Aunque esta metodología es técnicamente más difícil que un protocolo que utiliza un modelo animal más pequeño, en general, el protocolo es relativamente sencillo una vez que todas las piezas están en su lugar.
Es difícil describir todos los componentes de un sistema de imágenes y perfusión por texto, por lo que la demostración visual de este proceso ayudará a reproducir una preparación exitosa. Después de aislar el corazón con la aorta ascendente intacta, sumerge el órgano extirpado en cardioplejia helada y usa un par de hemostats para agarrar la pared de la aorta. Deslice el recipiente sobre una cánula acanalada unida a un tubo conectado a un litro de medio de cardioplegia helada suspendida aproximadamente 95 centímetros por encima del corazón.
Permita que el líquido llene la aorta hasta que el recipiente se desborde para evitar que las burbujas entren en la vasculatura y utilice cinta umbilical para asegurar la aorta a la cánula. Ate los hemostats para soportar el peso del corazón mientras cuelga de la cánula para asegurar aún más el tejido y permitir que el medio frío retrate el corazón a una presión constante de 70 milímetros de mercurio por gravedad. Transfiera el oído al sistema de 37 grados Celsius Langendorff sin introducir aire en la cánula.
Y permitir que el ritmo sinusal normal enjuague la vasculatura de cualquier sangre restante y cardioplegia. En caso de arritmias impactantes, coloca paletas externas en el ápice y la base del corazón para desfibrilar el órgano, dando un solo choque a cinco julios y aumentando en incrementos de cinco julios hasta que se logre 50 julios, cardioversión o ritmo inquebrantable. Luego, enjuague el corazón con al menos un litro de medio Krebs-Henseleit modificado sin recirculación para eliminar la sangre residual y la cardioplegia.
Cuando el medio corra claro a través del corazón, cierre el lazo circulante para recircular el perfuso. Para registrar un cable estándar al ECG durante el transcurso del estudio, conecte un electrodo de aguja del calibre 29 al epicardio ventricular cerca del ápice y conecte otro electrodo en la aurícula derecha. Conecte las entradas positivas y negativas de un bioamplificador diferencial al ápice y a la aurícula derecha, respectivamente, y conecte un electrodo de estímulo bipolar en la aurícula derecha y un segundo electrodo de estímulo bipolar al ventrículo izquierdo lateral para fines de ritmo.
Acelera el corazón usando un estimulador de electrofisiología, con la corriente inicial ajustada al doble del umbral diastólico y un ancho de pulso de un milisegundo. Para identificar el umbral de ritmo, aplique una serie de impulsos de estímulo de uno a dos miliamperios con un ancho de pulso de un milisegundo a longitudes de ciclo de ritmo definidas para garantizar una respuesta de estímulo consistente. Realice un ritmo de estímulo adicional utilizando un tren de ritmo S1, S1 o S1, S2.
Disminuya la longitud del ciclo de ritmo S2 paso a paso en 10 milisegundos hasta que el ritmo no pueda capturarse. A continuación, suba a la penúltima longitud del ciclo de ritmo y disminuya las longitudes del ciclo en intervalos de un milisegundo para determinar la longitud del ciclo de ritmo más preciso antes de la pérdida de captura. Para establecer el período refractario efectivo ventricular, utilice el electrodo de estímulo en el ventrículo izquierdo lateral para identificar el intervalo S1, S2 más corto en el que el latido prematuro S2 inicia la despolarización ventricular.
Para definir la longitud del ciclo de Wenckebach, utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha para encontrar el intervalo S1, S1 más corto en el que una conducción auriculoventricular uno a uno se propaga a través de la vía de conducción normal. Para definir el tiempo de recuperación del nodo sinusal, utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha para aplicar un tren de ritmo S1, S1 y medir el retardo de tiempo entre el último impulso en el tren de ritmo y la recuperación de la actividad mediada por nodos sinoauriales espontáneos. Para establecer el período refractario efectivo del nodo auriculoventricular, utilice el electrodo de estímulo en la aurícula derecha.
Encuentre el intervalo de acoplamiento S1, S2 más corto en el que la estimulación auricular prematura es seguida por un potencial Desagregación hisbundle que provoca un complejo QRS, lo que significa despolarización ventricular. Para el mapeo óptico de la tensión transmembrana y el calcio intracelular, primero agregue lentamente hasta cinco mililitros de tinte de voltaje proximal recién preparado a la cánula aórtica seguida de la adición lenta de tinte de calcio recién preparado. A continuación, coloque el hardware de imágenes para centrarse en un campo de visión adecuado y conecte la cámara a una estación de trabajo.
Adquiera imágenes utilizando el software seleccionado con un tiempo de exposición de 5 a dos milisegundos. Y realice una alineación de imagen con la ayuda de software que puede dividir y superponer las regiones deseadas y mostrar una resta en escala de grises o adición de pseudocolor a cualquier desalineación de resaltado. Con la iluminación ambiental minimizada, pruebe las luces LED para garantizar una iluminación épica y épica de forma uniforme, según lo determinado por la profundidad del sensor.
Luego, imagine el miocardio durante el ritmo sinusal, la fibrilación ventricular o el ritmo dinámico utilizando el electrodo de estimulación situado en el ventrículo izquierdo, comenzando con una longitud de ciclo de ritmo de 350 milisegundos y disminuyendo en 10 a 50 milisegundos para generar curvas de restitución. Para confirmar la adquisición de una señal óptica de calidad a lo largo del experimento, abra un archivo de vídeo, seleccione una región de interés y trace la fluorescencia media a lo largo del tiempo. Al final del experimento, retire el corazón del sistema y drene la perfusión.
A continuación, enjuague el tubo del sistema y las cámaras con agua purificada. Para un mantenimiento rutinario, enjuague periódicamente el sistema con solución detergente según sea necesario. En estos estudios representativos, el procedimiento se realizó en modelos intactos, como se demostró, que oscilaban en tamaño de 2,5 a 10,5 kilogramos de peso corporal y de 18 a 137 gramos de peso cardíaco.
Después de transferir el corazón aislado a un sistema Langendorff, la frecuencia cardíaca se estabiliza a unos 70 latidos por minuto dentro de aproximadamente 10 minutos de desfibrilación y permanece constante durante toda la duración del estudio. Normalmente se mide un caudal medio de aproximadamente 184 mililitros por minuto. Se ralentiza a 70 mililitros por minuto después de perfumar con el medio calentado que contiene un desacoplador mecánico.
El plomo de dos ECG se puede registrar a lo largo de la duración del estudio durante el ritmo sinusal o en respuesta al ritmo externo para cuantificar los parámetros electrofisiológicos. Los experimentos de mapeo óptico también se pueden realizar durante el ritmo sinusal y la fibrilación ventricular espontánea. Se pueden obtener imágenes representativas de un corazón cargado de tinte con los potenciales de acción óptica correspondientes.
Y los transitorios de calcio se pueden recoger de dos regiones de interés en la superficie epicardial. Además, el ritmo epicardial dinámico se puede utilizar durante los experimentos de mapeo óptico para normalizar cualquier ligera diferencia en las frecuencias cardíacas intrínsecas. Las señales crudas se pueden utilizar para representar el tiempo de acoplamiento transitorio de calcio potencial de acción, el tiempo de activación y duración, y la restitución eléctrica y de calcio.
Es importante evitar permitir que las burbujas entren en la aorta, minimizar el tiempo de transferencia del animal al sistema, y para apoyar el corazón más grande. La electrofisiología y los datos de señales ópticas se pueden analizar después de la adquisición. Además, el corazón se puede conservar después del estudio para la histología, inmunosupresión o análisis de expresión génica.
Estamos usando esta técnica para caracterizar el desarrollo cardíaco juvenil y examinar el impacto de las exposiciones ambientales en la fisiología cardíaca. Los desacopladores mecánicos utilizados para minimizar el movimiento y los productos químicos antiespumantes utilizados para abordar la espuma de albúmina son tóxicos, por lo que el uso del equipo de protección personal adecuado es absolutamente esencial.
