Este video demuestra la producción y aplicación de rebanadas hepáticas cortadas con precisión como un modelo experimental ex vivo de biología del tejido hepático. Las rodajas hepáticas cortadas con precisión ocupan un nicho experimental que existe entre los estudios en animales in vivo y los métodos de cultivo celular in vitro. Esta técnica tiene varios beneficios clave sobre los estudios en animales in vivo, incluyendo la capacidad de utilizar muestras de control y tratamiento del mismo hígado, el aislamiento del tejido hepático para eliminar los efectos fuera de destino de otros sistemas de órganos, y la capacidad de utilizar reactivos que podrían tener un efecto negativo si se aplica a un ratón vivo entero, por ejemplo, inhibidores de vías tóxicas.
La técnica consiste en utilizar una cuchilla vibratoria lateral para cortar rodajas hepáticas ultradelgadas de tejido hepático viable seguidas de cultivo de tejido de laboratorio. Las vibraciones de la hoja evitan el desgarro causado por la tensión de cizallamiento. En este ejemplo, mostraremos las técnicas para la preparación de rebanadas hepáticas ex vivo viables, y demostraremos la utilidad del cultivo de la rebanada hepática en experimentos de ejemplo donde este tejido ex vivo se trata con ácidos biliares para estimular la lesión hepática colestásica para evaluar los mecanismos de la fibrogénesis hepática.
Inserte la cuchilla en el brazo de corte. Desinfectar la cuchilla y el brazo de corte con una solución de etanol al 70%. Siempre tenga cuidado de evitar el contacto con la cuchilla.
Desinfecte la bandeja tampón con una solución de etanol al 70% y limpie con un tejido estéril. Inserte la bandeja de almacenamiento en el vibratome y apriete el tornillo de montaje. Ajuste el brazo de corte a la altura máxima disponible.
Compruebe el ángulo de la hoja. En nuestro vibratomo, utilizamos un ángulo de 10 grados desde horizontal, con la hoja inclinada hacia abajo hacia la muestra. Asegúrese de que el ángulo de la hoja esté bien fijado.
Desinfectar el soporte de la muestra, de nuevo, con una solución de etanol al 70%. Conecte el agua de refrigeración para el enfriador termoeléctrico Peltier, situado debajo de la bandeja de almacenamiento. Algunos modelos de vibratomo utilizan un baño de hielo para enfriar en su lugar.
Fije el tubo de agua a un drenaje y encienda el agua. Ajuste el enfriador a cuatro grados centígrados. Agregue el búfer Krebs-Henseleit helado a la bandeja de búfer.
Todos los instrumentos y materiales quirúrgicos deben ser estériles. Los ratones deben ser profundamente anestesiados o eutanasiados. Las superficies de la piel de los ratones se desinfectaron humectantes con una solución de etanol al 70%.
Haga una incisión de línea media en la piel desde la base de la cavidad abdominal hasta el diafragma. Usando fórceps y tijeras limpias, abra la cavidad abdominal. Retire el hígado rápidamente, sin dañar los lóbulos.
Empuje el hígado hacia abajo y corte el tejido conectivo en la parte superior del hígado. Empuje el hígado hacia arriba. Sostenga el área vascular central del hígado con los fórceps y tire hacia arriba.
Cortar los vasos sanguíneos del tejido conectivo. Tenga cuidado de no dañar los lóbulos hepáticos, y también, tenga cuidado de no cortar en el tracto gastrointestinal. Coloque el hígado extraído en un plato estéril de tampón Krebs-Henseleit helado.
Separe el hígado en lóbulos individuales. Seleccione un lóbulo hepático y coloque el lado plano hacia abajo en un nuevo plato estéril. Mantenga otros lóbulos sobre hielo en el búfer Krebs-Henseleit.
Recortar los bordes de los lóbulos hepáticos. El recorte es importante, particularmente en el borde que entrará en contacto con la cuchilla de corte primero, ya que tener un borde de tejido relativamente perpendicular a la cuchilla de corte evitará la compresión de tejido que puede ocurrir en ángulos poco profundos. Cortar el tejido alrededor de los otros tres bordes elimina gran parte de las cápsulas fibrosas en el borde del tejido, y por lo general permite una extracción más fácil de las rebanadas de tejido.
Coloque una fina capa de pegamento de cianoacrilato en el borde frontal del soporte de la muestra, ligeramente más grande que los lóbulos hepáticos recortados. Retire cualquier residuo de tampón del tejido utilizando material absorbente estéril. Coloque el lóbulo hepático sobre pegamento de cianoacrilato, con el borde más grande orientado hacia el frente.
Dejar curar en el aire durante uno o dos minutos. Coloque el tejido unido al soporte de la muestra en el vibratoma. Ajuste la velocidad del vibratomo.
Baje la cuchilla de corte hasta que se encuentre justo encima del lóbulo hepático. Ejecute el brazo de corte vibratorio sobre la muestra. La vibración de la cuchilla en esta máquina se activa mediante el pedal.
Vuelva a colocar la cuchilla hacia atrás y baje la altura de la hoja en 250 micrómetros. Repita este proceso hasta que se extraiga la capa superior del tejido. Deseche la primera o dos rebanadas, ya que estas contendrán la cápsula de Glisson, y por lo tanto, no contendrán mucho tejido hepático funcional.
Para cortar las rodajas de hígado, avance lentamente la hoja vibratoria en el tejido girando el mango. Utilice un pincel pequeño para guiar suavemente el tejido durante el proceso de corte. Utilice el pincel para recoger la sección de tejido cortado y, a continuación, coloque la sección de tejido en un tubo estéril que contenga el tampón Krebs-Henseleit para su almacenamiento.
Cuando no esté en uso, mantenga este tubo sobre hielo. Algunas veces, el tejido se desgarra durante el proceso de corte, pero para la mayoría de los propósitos, el tejido todavía es utilizable. Cortar las rodajas de tejido hasta cerca del pegamento de cianoacrilato.
No cortes en el pegamento. Repita con los otros lóbulos hepáticos, que están sentados sobre hielo, hasta obtener el número requerido de rodajas de tejido. Para limpiar el soporte de la muestra, utilice una cuchilla para raspar la mezcla de pegamento y tejido, o la mezcla se puede suavizar utilizando disolventes como la acetona o el sulfóxido de dimetil.
En una capucha de cultivo de tejido, pipetear un ml de medio Williams'E que contenga un 10% de suero bovino fetal y antimicrobianos en una placa de 12 pozos. Retire las rodajas de tejido remondo suavemente la mezcla y la punta en un plato estéril. Cortar el tejido en un tamaño más o menos uniforme.
En este ejemplo, apuntamos a cortes de tejido con un área de superficie de alrededor de 50 milímetros cuadrados. Tenga cuidado de examinar las rodajas de tejido para ver si hay consistencia. Las rodajas más oscuras sugieren que el grosor del tejido aumenta y debe desecharse.
Las rodajas más ligeras sugieren la presencia de pegamento de cianoacrilato curado, y deben desecharse. Transfiera las rodajas de tejido a la placa de 12 pozos que contiene un mililitro de medios. Incubar las rodajas de hígado en condiciones normales de cultivo de tejido.
Si es posible, utilice métodos para mejorar la disponibilidad de oxígeno en las rodajas de tejido. El día después, cambie el medio con una pipeta manual para evitar la pérdida de tejido por succión. Las rodajas de hígado cortadas con precisión ya están listas para uso experimental.
Para nuestra aplicación, hemos tratado las rodajas hepáticas con ácidos biliares durante dos días, y homogeneizado en tampón de lelisis para la extracción de ARN mensajero y el análisis qPCR. Para examinar la viabilidad de las rebanadas hepáticas cortadas con precisión a lo largo del tiempo, utilizamos los niveles de ATP como un proxy para la viabilidad celular. Los niveles de ATP se normalizaron a proteínas, y se midieron en varios puntos de tiempo después del aislamiento.
Los niveles de ATP se redujeron en las muestras inmediatas y de una hora, sin embargo esto se recuperó en tres horas. Después de esto, los niveles de ATP se mantuvieron durante cinco días, aunque tendencia a la baja con el tiempo. La tinción de H&E se utilizó para examinar las rodajas de hígado cortadas con precisión que se mantuvieron en cultivo durante un máximo de cinco días.
La morfología tisular sugería algunas necrosis que ocurren en el segundo día, con necrosis grave sucediendo en el día cinco. Debido a la necrosis que ocurre entre los días dos y cinco, recomendamos que la utilidad experimental de esta técnica se limite a unos tres días. Sin embargo, Esto podría mejorarse mediante el uso de mejores técnicas de administración de oxígeno a las rebanadas de tejido.
Las rodajas de hígado cortadas con precisión también parecen tener engrosamiento de las fibras de colágeno en relación con el tiempo en cultivo. Esto sugiere que se producen procesos fibrogénicos espontáneos. En el experimento de ejemplo, las rodajas de hígado cortadas con precisión se trataron con tres ácidos biliares separados durante dos días, para imitar la colestasis hepática.
Al examinar la expresión de ARNm de tres genes específicos de colangiocito, los dos ácidos biliares conjugados, los ácidos glicólicos y taurocólicos, aumentaron significativamente la expresión tanto de la citoqueratina-19 como de la connexina-43. Esto es consistente con el desarrollo de colangiocitos. Después de ver este video, usted debe tener una buena comprensión de cómo crear rebanadas de hígado cortadas con precisión, y cómo realizar el cultivo básico de tejido.
Las rodajas de hígado cortadas con precisión se pueden utilizar para una amplia gama de aplicaciones, incluyendo investigaciones experimentales en la expresión de ARN, expresión de proteínas, epigenética, unión al ADN, metabolismo, mecanismos de infección, invasión del cáncer, farmacología, biología celular y estudios de secreción, sólo para nombrar algunos.
