Este documento describe un método simple para el ensayo de heridas en un sistema de modelo tridimensional de cultivo de órganos multidimensionales y multidimensionales. Hacemos esto usando ojos de cerdo, pero incluso si usted no está familiarizado con los ojos, usted puede hacer este ensayo. Como visión general, recibimos ojos porcinos, cortamos los globos, hicimos una herida circular en la córnea que atraviesa el epitelio y alrededor de un tercio del estroma.
Cortamos la córnea, y la montamos en una base de agar, y ponemos esta construcción en la incubadora. El tejido se llenará creando una cicatriz en la córnea. No es necesario añadir ningún factor de crecimiento, o incluso suero.
Esto se hace en medios sin suero. Aunque esto se realiza en la córnea, se puede utilizar como un sistema modelo para la curación de fibromas en general. Como muchas de las vías celulares que se activan durante la cicatrización son similares entre los sistemas.
En una capucha de bioseguridad, utilice una cuchilla quirúrgica de borde recto para extraer el globo de la tapa de una tabla de cortar limpiada con etanol y eliminar el exceso de tejido graso de cada ojo. Sosteniendo el globo limpio posteriormente con fórceps inmediatamente sumergir el ojo en PBS seguido de tres caídas rápidas en 10%yodo, y dos caídas rápidas en PBS. Luego envuelva el ojo circunferencialmente con un tejido de laboratorio limpio para envolver con suficiente presión para lograr una superficie de córnea tensa sin tener en contacto con la córnea.
Usando una trebenta de seis milímetros, penetra el epitelio en el estroma anterior en el centro de la córnea sin hacer una herida de espesor completo a través de toda la córnea, y gira la trepa 180 grados en el sentido de las agujas del reloj y en el sentido contrario a las agujas del reloj cinco veces mientras aplicas presión ligera para profundizar la herida. Cuando la herida es lo suficientemente profunda como para permitir que un colgajo de tejido sea levantado con fórceps, utilice una cuchilla quirúrgica para cortar la solapa paralela al globo mientras continúa levantando la córnea anterior dentro del margen de la herida. Cuando se haya quitado toda la colgajo, se debe ubicar una herida circular en el centro de la córnea.
Para cosechar la córnea, agarra el ojo con el tejido de laboratorio, y usa una cuchilla quirúrgica para hacer una pequeña incisión a un milímetro del borde de la córnea para incluir el limbo y la colección de tejidos. Usando tijeras pequeñas y afiladas continúa la incisión alrededor del globo manteniendo un margen milimétrico a través de la córnea para mantener el limbo en tacto. A continuación, coloque la córnea, del lado de la herida hacia abajo, en un plato de 60 milímetros o 100 milímetros que contenga un mililitro de PBS.
Para montar la córnea, utilice dos pares de fórceps para sostener el lado epitelial de la córnea hacia arriba para crear una taza, y utilice una pipeta de transferencia estéril para agregar solución de agar caliente en la córnea hasta que la copa esté llena. Después de que el agar se endurezca, coloque cuidadosamente la córnea en una nueva placa de 60 milímetros lado agar hacia abajo y cubra la placa con una tapa. Luego agregue cuatro mililitros de medio libre de suero suplementado a cada plato de córneas manteniendo las córneas en una interfaz aire-líquido en el borde del limbar en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados en 5%dióxido de carbono, y humedeciendo las superficies corneales una vez al día con una gota de medio libre de suero suplementado del medio acondicionado en el plato para mantener los tejidos hidratados.
Para el derribo genético, mezcle cinco microlitros de pequeña interferencia o siRNa con 50 microlitros de medio esencial mínimo sérico reducido y dos microlitros de reactivo de transfección. Con 50 microlitros de medio sérico reducido por córnea. Después de cinco minutos, mezcle las dos mezclas y agregue 200 microlitros de medio mínimo sérico reducido a cada mezcla de siRNA.
A continuación, pipetear las soluciones de siRNA caen sabiamente sobre cada herida. A continuación, poner las córneas en la incubadora. Después de tres horas, utilice el medio de cada plato para lavar el siRNA de las superficies corneales, y reemplace el medio acondicionado en cada plato con un medio libre de suero fresco suplementado más antibióticos.
Luego devuelva los cultivos corneales a la incubadora de cultivo celular, e incubar durante dos semanas. Seis horas después de la herida, el epitelio corneal está ausente. Seis días después de la herida, el epitelio vuelve a crecer.
La tinción de aminoácidos de fluorescencia con actina muscular lisa alfa revela un gradiente de miofibroblastos activos a lo largo del margen de la herida desde el estroma anterior hasta el posterior. La tinción inmuno-histoquímica para la actina muscular lisa alfa revela un aumento dramático en la expresión de proteína de actina muscular lisa alfa en heridos además de córneas de siRNA de control. En comparación con el siRNA de proteína no asado y objetivo tratado, las córneas heridas.
Del mismo modo, el dominio adicional de fibronectina A está regulado al al ras en las córneas heridas tratadas con arINE en comparación con las córneas heridas tratadas con siRNA con proteínas no asanadas y diana. Demostrar un derribo exitoso de la proteína objetivo. Además, el tratamiento de las córneas heridas con la toxina que ataca inespecíficamente a la proteína diana previene la ree epitelización y resulta en la muerte celular cualitativa, una matriz desorganizada y vacuolas estromales que sugieren que la toxina no promueve la curación en la concentración ensayada.
En conclusión, al intentar este procedimiento es importante recordar mantener la hoja paralela al tejido durante el corte, para que no penetre en el globo. Con este ensayo se pueden emplear diferentes técnicas de hiriente, como quemaduras químicas o raspaduras epiteliales. También se puede utilizar para ensayos de toxicidad de drogas para determinar si el epitelio sana y a qué velocidad.
Este es un sistema de modelo de cultivo de órganos ex vivo que puede preceder a sus estudios de cicatrización de heridas in vivo.
