Un método generalizado para determinar la composición del ácido fenólico soluble libre y la capacidad antioxidante de los cereales y las legumbres. Los cereales integrales, incluidos los cereales y las legumbres, forman una parte sustancial de las dietas humanas. Su relevancia nutricional para los seres humanos ha sido reconocida durante mucho tiempo.
Sin embargo, más recientemente, se han reportado sus beneficios antioxidantes protectores para la salud. Los ácidos fenólicos que se encuentran en las capas externas de granos de los cereales y la capa de semillas de las legumbres contribuyen a las propiedades antioxidantes de los granos enteros. Eliminan los radicales libres que causan daño oxidativo a las biomoléculas.
Las dos clases de ácidos fenólicos que se encuentran en los granos enteros son los ácidos hidroxibenzoicos y los ácidos hidroxicinámicos. Este estudio proporciona un método simple para extraer ácidos fenólicos de grano entero y determinar su capacidad antioxidante in vitro. Use cinco muestras de granos enteros para este estudio, trigo duro, maíz amarillo, caupí de ojo negro, soja y frijol rojo.
Pese con precisión 100 miligramos de la muestra de harina de grano entero directamente en un tubo de microcentrífuga de dos mililitros de color ámbar. El color oscuro del tubo ayuda a prevenir la exposición de la mezcla a la luz. Agregue un mililitro de metanol acuoso al 80% a cada uno de los tubos que contienen ejemplos.
Vórtice brevemente para mezclar la solución de metanol y la muestra. Sonicar las muestras durante 60 minutos para extraer los compuestos fenólicos solubles libres. Coloque una cubierta sobre las muestras durante la duración de la sonicación para mayor protección contra la luz.
Después de la sonicación, centrifugue las mezclas a 20, 000 veces G durante cinco minutos para sedimentar los residuos sólidos, dejando el sobrenadante en la parte superior. Los compuestos fenólicos libres estarán presentes en el sobrenadante después de la centrifugación. El sobrenadante debe filtrarse antes de inyectarse en el instrumento HPLC.
Para filtrar el sobrenadante, retire el émbolo de una jeringa de 3 ml y conecte un filtro de jeringa. El filtro debe tener un tamaño de poro no mayor de 0,22 micrómetros. Pipetear aproximadamente 0,4 mililitros del sobrenadante en la parte superior de la jeringa.
Vuelva a insertar el émbolo y empuje el líquido a través del filtro en un vial de HPLC que contenga un inserto de vial. Una vez que el instrumento se ha configurado para ejecutar el método descrito en el manuscrito para el análisis de HPLC, cargue los viales en el carrusel para que se correspondan con la lista de muestras. Obtenga cromatogramas de HPLC a 320 nanómetros y 280 nanómetros, mostrando picos distintos que representan diferentes compuestos fenólicos.
Utilizando curvas estándar apropiadas, cuantifique los ácidos hidroxicinámicos a 320 nanómetros, ya que tienen una absorbancia máxima en esta longitud de onda. Por el mismo principio, cuantificar los ácidos hidroxibenzoicos a 280 nanómetros. Use Trolox, un análogo soluble en agua de la vitamina E, como estándar para estimar la capacidad antioxidante in vitro de los extractos de granos enteros.
Pesa con precisión un miligramo de Trolox en un tubo Falcon. Disolver con cuatro mililitros de metanol acuoso al 50% para preparar una solución madre de un milimole por litro, que es lo mismo que 1000 micromoles por litro. Prepare seis concentraciones de Trolox que sean 50, 100, 200, 400, 600 y 800 micromoles por litro para trazar curvas estándar para la estimación de la capacidad de eliminación de radicales DPPH y la capacidad antioxidante equivalente de Trolox, TEAC.
Del mismo modo, prepare concentraciones de Trolox de 6.25, 12.5, 25 y 50 micromoles por litro para estimar la capacidad de absorción de radicales de oxígeno, ORAC. Componga el volumen total de cada concentración a 500 microlitros, como se muestra en la tabla uno. Diluya los extractos de muestra con metanol antes del análisis.
Aquí, los extractos de maíz amarillo y caupí se diluyeron dos veces. Los extractos de trigo y frijol se diluyeron cinco veces, mientras que el extracto de soja se diluyó 10 veces con metanol. Pese 8,23 miligramos de ABTS en un tubo de microcentrífuga ámbar limpio de dos mililitros de capacidad.
A continuación, pese 1,62 miligramos de persulfato de potasio en un tubo de microcentrífuga de ámbar limpio de dos mililitros de capacidad. Disuelva cada uno de los productos químicos pesados en un mililitro de agua destilada mediante vórtice. Esto da como resultado una solución ABTS de 16 milimolares y una solución de persulfato de potasio de seis milimolares.
Prepare la solución madre de ABTS mezclando las soluciones de ABTS y persulfato de potasio en volúmenes iguales. La solución cambiará inmediatamente a un color oscuro. Deje que esta mezcla se incube en la oscuridad durante 12 a 16 horas.
Diluya la solución madre de ABTS 30 veces con solución salina tamponada con fosfato milimolar para formar la solución de trabajo de ABTS. Para hacer esto, agregue 58 mililitros de PBS milimolares a dos mililitros de la solución de trabajo ABTS. La solución de trabajo contendrá 0,27 milimolares ABTS y 0,1 milimolares de persulfato de potasio.
Para el análisis, coloque 10 microlitros de cada extracto diluido en una microplaca de 96 pocillos. Agregue 190 microlitros de solución de trabajo ABTS a cada pozo e incube durante 60 minutos. Mida la absorbancia de las mezclas de reacción a 750 nanómetros en un lector de microplacas.
Utilice los estándares Trolox en concentraciones que van de 100 a 800 micromoles por litro para trazar una curva de calibración. El ensayo antioxidante DPPH requiere un compuesto generador de radicales, DPPH. Pesa 1,2 miligramos de DPPH en un tubo centrífugo vacío de 15 mililitros de capacidad.
Disolver el DPPH en metanol para preparar una solución de 60 micromolares. El ensayo DPPH prueba la capacidad de los extractos de muestra para eliminar los radicales libres producidos por DPPH. Agregue cinco microlitros de extracto de muestra en los pozos de microplacas.
A continuación, agregue 195 microlitros de solución metanólica DPPH micromolar de 60 e incube durante 60 minutos. Mida la absorbancia a 515 nanómetros. Utilice los estándares trolox para trazar una curva de calibración.
La figura uno muestra la estructura de los ácidos hidroxibenzoicos que se encuentran en los granos enteros. En este estudio actual, el ácido vanílico fue el único ácido hidroxibenzoico identificado. La figura dos muestra la estructura de los ácidos hidroxicinámicos que se encuentran en los granos enteros.
En el estudio actual, se identificaron los ácidos p-cumárico, cafeico y ferúlico en las muestras. La tabla dos muestra los ácidos fenólicos identificados en las muestras. Como se mencionó anteriormente, el ácido vanílico fue el único ácido hidroxibenzoico identificado en las muestras.
Se identificó solo en el extracto de caupí. El ácido cafeico hidroxicinámico se identificó solo en el frijol, mientras que el ácido p-cumérico se identificó en el maíz amarillo, el caupí y la soja. El ácido ferúlico se identificó en todas las muestras y fue el ácido fenólico predominante en las muestras.
La concentración total de los ácidos fenólicos en orden de mayor a menor fue en el orden soja, caupí, maíz amarillo y frijol o equivalente, seguido por el trigo. La tabla tres mostró el contenido fenólico total y la capacidad antioxidante de las muestras. La capacidad antioxidante comprendió la capacidad de eliminación de radicales DPPH, TEAC, ORAC y la capacidad antioxidante total de las muestras.
La capacidad antioxidante total es la suma de los valores dpph, TEAC y ORAC. Al igual que en la tabla dos, la soja tuvo la mayor capacidad antioxidante total. Sin embargo, en lugar de caupí, fue más bien frijol el que tuvo la segunda mayor capacidad antioxidante total, aunque el caupí tuvo el segundo mayor contenido total de ácido fenólico.
Esta anomalía está relacionada con las estructuras de los ácidos fenólicos individuales y el posible efecto antagonista del ácido hidroxibenzoico ácido vanílico sobre los efectos antioxidantes de los ácidos hidroxicinámicos en el caupí. Este estudio concluyó que los granos enteros difieren en sus composiciones de ácido fenólico. Entre los granos enteros estudiados, la soja tiene la mayor cantidad total de ácidos fenólicos y, en consecuencia, la mayor capacidad antioxidante.
