Tahılların ve baklagillerin serbest çözünür fenolik asit bileşimini ve antioksidan kapasitesini belirlemek için genelleştirilmiş bir yöntem. Tahıllar ve baklagiller de dahil olmak üzere kepekli tahıllar, insan diyetlerinin önemli bir bölümünü oluşturur. İnsanlarla besinsel ilgileri uzun zamandır bilinmektedir.
Bununla birlikte, daha yakın zamanlarda, antioksidan koruyucu sağlık yararları bildirilmiştir. Tahılların dış tahıl katmanlarında ve baklagillerin tohum kabuğunda bulunan fenolik asitler, kepekli tahılların antioksidan özelliklerine katkıda bulunur. Biyomoleküllere oksidatif hasara neden olan serbest radikalleri temizlerler.
Tam tahıllarda bulunan iki fenolik asit sınıfı, hidroksibenzoik asitler ve hidroksisinnamik asitlerdir. Bu çalışma, tam tahıllı fenolik asitlerin ekstraksiyonu ve in vitro antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi için basit bir yöntem sunmaktadır. Bu çalışma için beş tam tahıl örneği kullanın, durum buğdayı, sarı mısır, siyah gözlü börülce fasulyesi, soya fasulyesi ve kırmızı barbunya fasulyesi.
Tam tahıllı un numunesinin 100 miligramını doğrudan amber renkli, iki mililitre kapasiteli bir mikro santrifüj tüpüne doğru bir şekilde tartın. Tüpün koyu rengi, karışımın ışığa maruz kalmasını önlemeye yardımcı olur. Örnek içeren tüplerin her birine bir mililitre% 80 sulu metanol ekleyin.
Metanol çözeltisini ve numuneyi karıştırmak için kısaca vorteks. Serbest çözünür fenolik bileşikleri çıkarmak için örnekleri 60 dakika boyunca sonikleştirin. Işıktan ek koruma için sonikasyon süresi boyunca örneklerin üzerine bir kapak koyun.
Sonikasyondan sonra, katı kalıntıları tortulamak için karışımları beş dakika boyunca 20.000 kez G'de santrifüj edin ve süpernatantı üstte bırakın. Santrifüjlemeden sonra süpernatantta serbest fenolik bileşikler bulunacaktır. Süpernatantın HPLC cihazına enjekte edilmeden önce filtrelenmesi gerekir.
Süpernatanı filtrelemek için, 3 mL'lik bir şırınganın pistonunu çıkarın ve bir şırınga filtresi takın. Filtre, 0,22 mikrometreden büyük olmayan bir gözenek boyutuna sahip olmalıdır. Pipet, şırınganın üst kısmına yaklaşık 0.4 mililitre süpernatant girer.
Pistonu tekrar takın ve sıvıyı filtreden bir şişe eki içeren bir HPLC şişesine itin. Cihaz, HPLC analizi için makalede özetlenen yöntemi çalıştıracak şekilde ayarlandıktan sonra, numune listesine karşılık gelmesi için şişeleri atlıkarıncaya yükleyin. Farklı fenolik bileşikleri temsil eden farklı zirveleri gösteren 320 nanometre ve 280 nanometrede HPLC kromatogramları elde edin.
Uygun standart eğrileri kullanarak, hidroksisinnamik asitleri 320 nanometrede sayısallaştırın, çünkü bu dalga boyunda maksimum emilime sahiptirler. Aynı prensibe göre, hidroksibenzoik asitleri 280 nanometrede sayısallaştırın. Tam tahıl ekstraktlarının in vitro antioksidan kapasitesini tahmin etmek için standart olarak E vitamininin suda çözünür bir analoğu olan Trolox'u kullanın.
Bir miligram Trolox'u bir Falcon tüpüne doğru bir şekilde tartın. Litre başına 1000 mikromol ile aynı olan litre başına bir milimol stok çözeltisi hazırlamak için dört mililitre% 50 sulu metanol ile çözün. DPPH radikal süpürme kapasitesi ve Trolox'a eşdeğer antioksidan kapasitesi TEAC'ın tahmini için standart eğrileri çizmek üzere litre başına 50, 100, 200, 400, 600 ve 800 mikromol olan altı Trolox konsantrasyonu hazırlayın.
Benzer şekilde, oksijen radikal absorbans kapasitesini tahmin etmek için litre başına 6.25, 12.5, 25 ve 50 mikromol Trolox konsantrasyonları hazırlayın, ORAC. Her konsantrasyonun toplam hacmini, tablo birde gösterildiği gibi 500 mikrolitreye kadar yapın. Analizden önce numune ekstraktlarını metanol ile seyreltin.
Burada, sarı mısır ve börülce özleri iki kez seyreltildi. Buğday ve barbunya fasulyesi ekstraktları beş kez, soya fasulyesi ekstresi ise metanol ile 10 kez seyreltildi. 8,23 miligram ABTS'yi temiz, iki mililitre kapasiteli, amber mikro santrifüj tüpüne tartın.
Daha sonra, 1.62 miligram potasyum persülfatı temiz, iki mililitre kapasiteli, amber mikro santrifüj tüpüne tartın. Tartılan kimyasalların her birini vorteks yaparak bir mililitre damıtılmış suda çözün. Bu, 16 milimolar ABTS çözeltisi ve altı milimolar potasyum persülfat çözeltisi ile sonuçlanır.
ABTS ve potasyum persülfat çözeltilerini eşit hacimlerde karıştırarak ABTS stok çözeltisini hazırlayın. Çözelti hemen koyu bir renge dönüşecektir. Bu karışımın karanlıkta 12 ila 16 saat kuluçkaya yatmasına izin verin.
ABTS çalışma çözeltisini oluşturmak için ABTS stok çözeltisini 200 milimolar fosfat tamponlu salin ile 30 kez seyreltin. Bunu yapmak için, ABTS çalışma çözeltisinin iki mililitresine 58 mililitre 200 milimolar PBS ekleyin. Çalışma çözeltisi 0.27 milimolar ABTS ve 0.1 milimolar potasyum persülfat içerecektir.
Analiz için, her seyreltilmiş ekstraktın 10 mikrolitresini 96 kuyucuklu bir mikroplakaya yerleştirin. Her bir kuyucuğa 190 mikrolitre ABTS çalışma çözeltisi ekleyin ve 60 dakika boyunca inkübe edin. Bir mikroplaka okuyucuda 750 nanometrede reaksiyon karışımlarının emiciliğini ölçün.
Bir kalibrasyon eğrisi çizmek için Trolox standartlarını litre başına 100 ila 800 mikromol arasında değişen konsantrasyonlarda kullanın. DPPH antioksidan testi, radikal üreten bir bileşik olan DPPH'yi gerektirir. 1,2 miligram DPPH'yi 15 mililitre kapasiteli boş bir santrifüj tüpüne tartın.
60 mikromolar çözelti hazırlamak için DPPH'yi metanol içinde çözün. DPPH testi, numune ekstraktlarının DPPH tarafından üretilen serbest radikalleri temizleme yeteneğini test eder. Mikroplaka kuyucuklarına beş mikrolitre numune ekstresi ekleyin.
Daha sonra, 195 mikrolitre 60 mikromolar DPPH metanolik çözelti ekleyin ve 60 dakika boyunca inkübe edin. Absorbansı 515 nanometrede ölçün. Bir kalibrasyon eğrisi çizmek için Trolox standartlarını kullanın.
Birinci şekil, kepekli tahıllarda bulunan hidroksibenzoik asitlerin yapısını göstermektedir. Bu güncel çalışmada, vanillik asit tanımlanan tek hidroksibenzoik asitti. Şekil iki, kepekli tahıllarda bulunan hidroksisinnamik asitlerin yapısını göstermektedir.
Bu çalışmada, örneklerde p-kumarik, kafeik ve ferulik asitler tanımlanmıştır. Tablo iki, numunelerde tanımlanan fenolik asitleri göstermektedir. Daha önce de belirtildiği gibi, vanillik asit, numunelerde tanımlanan tek hidroksibenzoik asitti.
Sadece börülce ekstraktında tanımlanmıştır. Hidroksisinnamik asit kafeik asit sadece böbrek fasulyesinde tanımlanırken, p-koumerik asit sarı mısır, börülce ve soya fasulyesinde tanımlanmıştır. Ferulik asit tüm örneklerde tanımlandı ve örneklerde baskın fenolik asitti.
Fenolik asitlerin en büyükten en küçüğe doğru toplam konsantrasyonu, soya fasulyesi, börülce, sarı mısır ve böbrek fasulyesi veya eşdeğeri sırasına göre, ardından buğday geldi. Tablo üç, örneklerin toplam fenolik içeriğini ve antioksidan kapasitesini göstermiştir. Antioksidan kapasite, numunelerin DPPH radikal süpürme kapasitesi, TEAC, ORAC ve toplam antioksidan kapasitesini içermektedir.
Toplam antioksidan kapasitesi DPPH, TEAC ve ORAC değerlerinin toplamıdır. Tablo iki'ye benzer şekilde, soya fasulyesi en yüksek toplam antioksidan kapasitesine sahipti. Bununla birlikte, börülce yerine, ikinci en yüksek toplam antioksidan kapasiteye sahip olan böbrek fasulyesiydi, ancak börülce ikinci en yüksek toplam fenolik asit içeriğine sahipti.
Bu anomali, bireysel fenolik asitlerin yapıları ve hidroksibenzoik asit vanililik asidin börülcedeki hidroksisinnamik asitlerin antioksidan etkileri üzerindeki olası antagonistik etkisi ile ilgilidir. Bu çalışma, kepekli tahılların fenolik asit bileşimlerinde farklılık gösterdiği sonucuna varmıştır. İncelenen kepekli tahıllar arasında, soya fasulyesi en yüksek toplam fenolik asit miktarına ve buna bağlı olarak en yüksek antioksidan kapasiteye sahiptir.
