Hasta donde sabemos, este es el primer ejemplo de un protocolo de multiplexación basado en cuentas que utiliza dos señales de reportero para medir simultáneamente dos resultados por analito. Esta técnica permite al usuario medir IgM e IgG específicas del antígeno al mismo tiempo, con menos muestra y un tiempo más corto para obtener resultados. Si bien este método de doble reportero es específico para la isotipificación de anticuerpos, podría adaptarse para medir otros pares de analitos, como modificaciones post-tradesales o formas de fármacos libres versus unidos.
Demostrando nuestro procedimiento hoy tenemos al Dr. Steve Angeloni, científico senior de aplicaciones de campo para Luminex Corporation. Para comenzar el ensayo serológico dual reportero IgG e IgM, prepare las mezclas de cuentas multiplex requeridas de la cuenta de pareja individual y controle las existencias de cuentas a una concentración de una vez 10 a las seis cuentas por mililitro. A continuación, diluya las muestras de suero 100 veces agregando 10 microlitros de suero a 990 microlitros de tampón PBS-TBN, luego diluya las muestras otra diez veces agregando 20 microlitros de la dilución 1: 100 a 180 microlitros de PBS-TBN.
Cuando las mezclas de cuentas y las muestras de suero estén listas, agregue 50 microlitros de las mezclas de cuentas multiplex a los pozos asignados de una placa de microtitulación no vinculante de 96 pozos, luego agregue 50 microlitros de las muestras de suero diluido a los pozos apropiados. Una vez que se hayan agregado todas las muestras, cubra la placa con un sello de lámina de microplaca e incube en un agitador de placas calentado a 37 grados Celsius durante 15 minutos. Luego, separe las perlas de la mezcla de reacción colocando la placa en un separador de placa magnética durante dos minutos.
Manteniendo la placa en el imán, retire el sello de la lámina. Luego invierta cuidadosamente la placa sobre un contenedor de desechos y mueva suavemente el sobrenadante fuera de los pozos. Mientras mantiene la placa en el imán, seque la placa en papel absorbente.
Para lavar los pozos de reacción, retire la placa del imán de la placa y agregue 150 microlitros de PBS-TBN a cada pozo. Cubra la placa con un sello de lámina fresca e incube en el agitador calentado durante dos minutos antes de volver a colocarlo en el imán de la placa durante otros dos minutos. Mientras mantiene la placa en el imán, invierta la placa para desechar el sobrenadante y seque la placa en papel absorbente.
Después del segundo lavado de PBS-TBN, retire la placa del imán y agregue 100 microlitros de mezcla fresca de reactivos de detección a cada pozo. Después de cubrir la placa con un sello de lámina de microplaca, colóquela en un agitador de placas calentado durante 15 minutos y luego en un separador de placa magnética durante dos minutos. Mientras la placa está en el imán, deseche la mezcla de reactivos de detección invirtiendo la placa sobre un contenedor de residuos y secándola en papel absorbente.
Lave los pozos de reacción con PBS-TBN dos veces como se demostró anteriormente, luego retire la placa del imán. Agregue 100 microlitros de PBS-TBN a cada pozo, luego cubra la placa con sello de lámina y agite durante dos minutos a 37 grados centígrados. Retire el sello de la lámina y proceda a leer 50 microlitros de la muestra de cada pozo en el analizador de flujo.
Para leer la placa, seleccione el menú desplegable en la esquina superior izquierda, navegue hasta Configuración de placa, cargue la placa configurada previamente y seleccione Ejecutar placa. Expulse el soporte de la placa seleccionando el icono Expulsar, luego cargue la placa en el soporte de la placa y seleccione el icono De retracción para retraer el soporte de la placa. Una vez que el portador de la placa se haya prolongado en el analizador, seleccione el icono Ejecutar para comenzar a leer la placa.
Para el ensayo de neutralización de doble reportero, agregue 50 microlitros de las mezclas de cuentas multiplex a los pomos asignados de una placa de microtitulación no vinculante de 96 pomos, luego agregue 25 microlitros de dos microgramos por mililitro ACE2 a cada pozo y cubra la placa con un sello de lámina. Después de una incubación de dos minutos en un agitador de placas calentado, agregue 25 microlitros de diluciones de suero 1:500 a los pomos asignados. Una vez que se hayan agregado todas las muestras, realice los pasos de incubación, lavado, detección y análisis como se demostró previamente para el ensayo serológico.
Una prueba de anti-IgM conjugada con el tinte reportero DyLight 405 utilizando muestras de suero dentro de los cinco a 60 días posteriores al inicio de los síntomas y una muestra de suero de tira de IgG no produjo una señal alta para el antígeno de pico. Para muestras con una alta intensidad de fluorescencia media de IgM, las señales más altas se observaron para el dominio de unión al receptor y los antígenos de la nucleocápside. Si bien el título de IgM debería haber sido elevado en algunas muestras, los niveles de intensidad de fluorescencia media observados no excedieron las 140 unidades de IMF.
Además, el perla de control para IgM carecía de un rango dinámico significativo para la intensidad media de fluorescencia cuando se usaba DyLight 405 conjugado a anti-IgM en comparación con una ficoeritrina marcada como anti-IgM a la misma concentración. Para la detección de IgG, el conjugado violeta brillante tenía señales de intensidad de fluorescencia medianas más altas que el conjugado de estreptavidina del flúor Super Bright 436. Sin embargo, la intensidad de la señal para el conjugado violeta brillante varió a través de las valoraciones de ACE2.
Esta fluctuación de la señal por el brillante conjugado violeta a través de las concentraciones de ACE2 también interfirió con la determinación del porcentaje de inhibición por ACE2 en todo el rango de títulos de IgG. Para la detección de IgM, la ficoeritrina anti-IgM mostró señales más altas que las generadas por DyLight 549 anti-IgM humana. Al determinar la inhibición del ECA2 por ciento de la unión a IgM, hubo una diferencia leve pero insignificante entre los dos reactivos de detección de IgM.
Por lo tanto, uno de los pasos más importantes en el procedimiento es preparar su mezcla de cuentas multiplex a partir de sus existencias de cuentas individuales y asegurarse de hacerlo correctamente. Por lo tanto, este procedimiento también se puede utilizar para medir la eficacia de las vacunas y monitorear las respuestas inmunes a otros patógenos también.
