Este protocolo es significativo porque está diseñado para responder preguntas sobre el correlato de la función de la estructura de la válvula pulmonar murina, que generalmente es complicado debido a su heterogeneidad inherente. La fijación controlada y la imagen correlativa se utilizaron para capturar la estructura en múltiples escalas de longitud. Las imágenes locales de alta resolución se pueden mapear de nuevo a la ubicación anatómica precisa en la válvula pulmonar.
Tai Yi, Director de Microcirugía en el Centro de Medicina Regenerativa del Nationwide Children's Hospital. Comience por autoclave las herramientas necesarias para la disección del ratón, incluidas tijeras finas, microfuerzas, abrazaderas microvasculares, pinzas de aplicación de pinzas, soportes para microagujas, tijeras de resorte y retractores. Después de sacrificar a un ratón adulto C57BL/6, colóquelo en una posición dorsal recosta en una bandeja, asegure sus extremidades con cinta adhesiva y realice la toracotomía.
Exponga el corazón eliminando cualquier exceso de tejido adiposo y fascia, luego retire la aurícula derecha y perfunda el ventrículo izquierdo con solución salina a temperatura ambiente. Retire todo el corazón cortando la vena cava superior, la vena cava inferior, la arteria pulmonar y la aorta, y corte aproximadamente dos milímetros por encima de la unión ventriculoatrial, que servirá como conducto para la presurización. Retire los ventrículos izquierdo y derecho para exponer las cámaras a la presión atmosférica, asegurándose de que la estructura del tronco pulmonar no se vea afectada por la eliminación de los ventrículos.
Tubo de presurización anastomosa con la arteria pulmonar, dejando aproximadamente una distancia milimétrica entre la unión sinotubular y el extremo del tubo para acomodar grandes movimientos de las valvas y el tronco pulmonar. Eleve el depósito a una presión fisiológica análoga y llénelo con la solución salina. Pruebe el sistema de flujo a través para asegurarse de que no haya obstrucciones o burbujas de aire.
Conecte una llave de paso a la válvula pulmonar anastomosada y asegure un flujo adecuado a través de la tubería cambiando el tracto de salida. Una vez que el flujo sea suficiente, cambie el flujo de salida a la válvula pulmonar anastomosada y asegure la presurización del tronco pulmonar identificado por distensión del tronco. Después de confirmar la presurización del tronco pulmonar, incorporar gradualmente la solución fijadora primaria hasta purgar el 25% de la capacidad reservorio de la solución salina.
Coloque una gasa empapada en fijador sobre la muestra de tejido para evitar que se seque. Perfundir el fijador durante tres horas, rellenando el depósito para mantener una presión constante. Después de la perfusión, guarde la válvula cardíaca en la solución fijadora a cuatro grados centígrados hasta que se use hasta por una semana.
Para la tinción, lave la muestra fija de la válvula cardíaca tres veces con tampón de cacodilato molar frío de 0,15 durante cinco minutos y sumerja completamente la válvula cardíaca en una solución de 1,5 ferrocianuro de potasio, cacodilato molar de 0,15, cloruro de calcio milimolar y tetróxido de osmio al 2% en hielo durante una hora. Lave las muestras con agua destilada doble a temperatura ambiente colocándolas en un tubo durante cinco minutos con una ligera agitación. Después de tres lavados más, coloque la muestra en una solución de tiocarbohidrazida filtrada a temperatura ambiente.
Después de 20 minutos, lave la muestra tres veces con agua como se demostró anteriormente. A continuación, coloque la muestra en tetróxido de osmio al 2% a temperatura ambiente. Después de 30 minutos, lávelo con agua tres veces durante cinco minutos cada una e incube la muestra en acetato de uranilo al 1% durante la noche a cuatro grados centígrados.
Mientras tanto, prepare una solución de nitrato de plomo. Al día siguiente, realice el paso de lavado tres veces como se demostró anteriormente, luego incube el tejido de la válvula cardíaca en solución de aspartato de plomo a 60 grados Celsius durante 30 minutos. Lave las muestras tres veces más, luego realice un tratamiento de deshidratación en serie en los tejidos de las válvulas cardíacas con etanol 20, 50, 70 y 90% recién preparado en hielo durante cinco minutos cada uno, seguido de dos tratamientos posteriores con 100% etanol.
Después de la deshidratación, mueva los tejidos a acetona helada, luego colóquela en acetona fresca a temperatura ambiente durante 10 minutos. Para incrustar, haga la mezcla de resina de acuerdo con las especificaciones del fabricante. Coloque los tejidos en tratamientos posteriores de 25 a 75, 50 a 50 y 75 a 25 mezcla de resina a acetona durante dos horas cada uno.
Finalmente, coloque los tejidos en resina 100% durante la noche. Al día siguiente, coloque los pañuelos en resina fresca 100%. Después de dos horas, transfiera los tejidos a una cápsula de incrustación, agregue resina fresca 100% y colóquela en un horno de 60 grados Celsius durante 48 horas para curar.
Aquí se muestra la arteria pulmonar anastomosada extirpada antes y después de la aplicación de presión hidrostática. El tronco pulmonar se distiende radialmente, lo que indica que las valvas de la válvula pulmonar están en una configuración cerrada. La tomografía microcomputada confirmó la confirmación de la válvula pulmonar.
Las valvas se cerraron y el anillo fue circular, mientras que se observaron diversos grados de presurización inadecuada de la válvula pulmonar por fijación o colapso arterial. El volumen micro CT que renderiza secciones transversales virtuales se correlacionó con imágenes ópticas para confirmar la dirección y ubicación de corte. Las imágenes SBF SEM de alta resolución se tomaron en una región local dentro de un folleto cuando el bloque de muestra estaba en la ubicación y orientación deseadas.
Aquí se muestran imágenes correlacionadas entre el segmento virtual de renderizado de volumen micro CT, imágenes SBF SEM de baja resolución y SBF de alta resolución. En la representación 3D de una región segmentada de la válvula pulmonar, se pueden identificar componentes extracelulares como células endoteliales, células intersticiales valvulares y fibras extracelulares. Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que realizar la presurización es fundamental y garantizará que el rendimiento sea lo más alto posible.
