Este protocolo é significativo porque é projetado para responder perguntas sobre a função estrutural correlaciona da válvula pulmonar murina, o que é geralmente complicado devido à sua heterogeneidade inerente. A fixação controlada e a imagem correlativa foram utilizadas para capturar a estrutura em múltiplas escalas de comprimento. Imagens locais de alta resolução podem então ser mapeadas de volta para o local anatômico preciso na válvula pulmonar.
O médico que demonstrará o procedimento será o Dr. Tai Yi, diretor de Microcirurgia do Centro de Medicina Regenerativa do Hospital Infantil Nacional. Comece autoclavando as ferramentas necessárias para a dissecção do mouse, incluindo tesoura fina, microforceps, grampos microvasculares, fórceps de fixação, suportes de microavalente, tesoura de mola e retrações. Depois de eutanásia de um rato C57BL/6 adulto, coloque-o em uma posição dorsal recumbent em uma bandeja, fixe seus membros com fita e realize a toracotomia.
Exponha o coração removendo qualquer excesso de tecido adiposo e fáscia, em seguida, remova o átrio direito e persutilize o ventrículo esquerdo com solução salina de temperatura ambiente. Remova todo o coração cortando a veia cava superior, veia cava inferior, artéria pulmonar e aorta, e corte aproximadamente dois milímetros acima da junção ventriculoatrial, que servirá como o conduíte para pressurização. Remova os ventrículos esquerdo e direito para expor as câmaras à pressão atmosférica, garantindo que a estrutura pulmonar do tronco não seja afetada pela remoção dos ventrículos.
Tubo de pressurização anastomose com a artéria pulmonar, deixando uma distância de aproximadamente um milímetro entre a junção sinotubular e a extremidade da tubulação para acomodar grandes movimentos dos folhetos e tronco pulmonar. Eleve o reservatório a uma pressão fisiológica análoga e preencha-o com a solução salina. Teste o sistema de fluxo para garantir que não haja bloqueios ou bolhas de ar.
Conecte uma torneira à válvula pulmonar anastomosa e garanta o fluxo adequado através da tubulação, comutando o trato de saída. Uma vez que o fluxo seja suficiente, troque a vazão para a válvula pulmonar anastomosa e garanta a pressurização do tronco pulmonar identificado pela distensão do tronco. Após a confirmação da pressurização do tronco pulmonar, incorpore gradualmente a solução fixativa primária até que 25% da capacidade do reservatório da solução salina seja expurgada.
Coloque uma gaze fixada sobre a amostra de tecido para evitar a secagem. Perfunda o fixador por três horas, reabastecendo o reservatório para manter uma pressão constante. Após a perfusão, armazene a válvula cardíaca na solução fixativa a quatro graus Celsius até usar por até uma semana.
Para coloração, lave a amostra fixa da válvula cardíaca três vezes com tampão de cacodilato molar frio de 0,15 por cinco minutos e submerse completamente a válvula cardíaca em uma solução de ferrocineto de potássio de 1,5 potássio, 0,15 cacodilato molar, dois cloreto de cálcio milimolar e 2% de tetroxida de ódio no gelo por uma hora. Lave as amostras com água destilada dupla à temperatura ambiente colocando-as em um tubo por cinco minutos com leve agitação. Depois de mais três lavagens, coloque a amostra em solução de tiocarbohydrazida filtrada à temperatura ambiente.
Após 20 minutos, lave a amostra três vezes com água como demonstrado anteriormente. Em seguida, coloque a amostra em 2% de tetroxida de ósmio à temperatura ambiente. Após 30 minutos, lave-a com água três vezes por cinco minutos cada e incubar a amostra em acetato de 1%uranyl durante a noite a quatro graus Celsius.
Enquanto isso, prepare uma solução de nitrato de chumbo. No dia seguinte, realize a etapa de lavagem três vezes como demonstrado anteriormente, em seguida, incubar o tecido da válvula cardíaca na solução de aspartato de chumbo a 60 graus Celsius por 30 minutos. Lave as amostras mais três vezes, depois realize um tratamento de desidratação em série nos tecidos da válvula cardíaca com 20, 50, 70 e 90% de etanol no gelo por cinco minutos cada, seguido por dois tratamentos subsequentes com 100% de etanol.
Após a desidratação, mova os tecidos para acetona gelada e coloque-o em acetona fresca à temperatura ambiente por 10 minutos. Para incorporar, faça a mistura de resina de acordo com as especificações do fabricante. Coloque tecidos em tratamentos subsequentes de 25 a 75, 50 a 50 e 75 a 25 resina à mistura de acetona por duas horas cada.
Por fim, coloque os tecidos em 100% de resina durante a noite. No dia seguinte, coloque tecidos em resina fresca de 100%. Após duas horas, transfira os tecidos para uma cápsula de incorporação, adicione resina fresca de 100% e coloque-a em um forno Celsius de 60 graus por 48 horas para curar.
A artéria pulmonar anastomosada excizada antes e seguindo a aplicação da pressão hidrostática é mostrada aqui. O tronco pulmonar distends radialmente indicando que os folhetos da válvula pulmonar estão em uma configuração fechada. A tomografia microcomputada confirmou a confirmação da válvula pulmonar.
Os folhetos foram fechados e o anulô foi circular enquanto foram observados graus variados de pressurização inadequada da válvula pulmonar por fixação ou colapso arterial. O volume micro CT que renderiza seções transversais virtuais foi correlacionado com imagens ópticas para confirmar a direção e localização do corte. Imagens SBF SEM de alta resolução foram tiradas em uma região local dentro de um folheto quando o bloco de espécimes estava no local e orientação desejados.
Imagens correlacionadas entre o volume micro CT que renderiza fatia virtual, imagens SBF SEM de baixa resolução e alta resolução são mostradas aqui. Na representação 3D de uma região segmentada da válvula pulmonar, podem ser identificados componentes extracelulares como células endoteliais, células intersticiciais valvulares e fibras extracelulares. Ao tentar este protocolo, tenha em mente que realizar a pressurização é fundamental e garantirá que o rendimento seja o mais alto possível.
