Bu protokol önemlidir, çünkü murin pulmoner valfin yapı fonksiyonu ile ilgili soruları yanıtlamak için tasarlanmıştır, bu da doğasında bulunan heterojenliği nedeniyle genellikle zordur. Yapıyı birden fazla uzunluk ölçeğinde yakalamak için kontrollü fiksasyon ve korelatif görüntüleme kullanılmıştır. Yerel yüksek çözünürlüklü görüntüler daha sonra pulmoner kapakçık üzerindeki hassas anatomik konuma geri eşlenebilir.
Prosedürü gösteren, Nationwide Çocuk Hastanesi Rejeneratif Tıp Merkezi Mikrocerrahi Direktörü Dr.Tai Yi olacak. İnce makas, mikrokaplar, mikrovasküler kelepçeler, forseps uygulayan kelepçe, mikroneedle tutucular, yay makası ve retraktörler dahil olmak üzere fare diseksiyonu için gerekli aletleri otomatik olarak kapatarak başlayın. Yetişkin bir C57BL/6 fareyi ötenazi yaptıktan sonra, bir tepsiye dorsal bir recumbent pozisyonuna yerleştirin, uzuvlarını bantla sabitleyin ve torakotomiyi gerçekleştirin.
Fazla yağ dokusunu ve fasyayı çıkararak kalbi açığa çıkarın, ardından sağ kulakçık çıkarın ve sol ventrikülü oda sıcaklığında salin çözeltisi ile perfuse edin. Üstün vena kava, alt vena kava, pulmoner arter ve aort keserek tüm kalbi çıkarın ve basınçlandırma kanalı görevi görecek ventriküloatriyal kavşaktan yaklaşık iki milimetre yukarıda kesin. Odaları atmosferik basınca maruz bırakmak için sol ve sağ ventrikülleri çıkarın, ventrikülleri çıkararak pulmoner gövde yapısının etkilenmemesini sağlayın.
Pulmoner arter ile anastomoz basınçlandırma tüpü, broşürlerin ve pulmoner gövdenin büyük hareketlerini karşılamak için sinotubular kavşak ile borunun ucu arasında yaklaşık bir milimetre mesafe bırakır. Rezervuarı benzer bir fizyolojik basınca yükseltin ve tuzlu su çözeltisi ile doldurun. Tıkanıklık veya hava kabarcığı olmadığından emin olmak için akış sistemini test edin.
Anastomosed pulmoner valf içine bir stopcock takın ve çıkış yolunu değiştirerek borudan yeterli akışı sağlayın. Akış yeterli olduğunda, çıkışı anastomosed pulmoner valfe geçirin ve gövde distansiyonu ile tanımlanan pulmoner gövdenin basınçlandırılmasını sağlayın. Pulmoner gövdenin basınçlandırılmasını onayladıktan sonra, tuzlu çözeltinin rezervuar kapasitesinin% 25'i temizlenene kadar birincil fiksatif çözeltiyi kademeli olarak dahil edin.
Kurumasını önlemek için doku örneğinin üzerine fiksatif ıslatılmış bir gazlı bez yerleştirin. Sabitleyiciyi üç saat boyunca perfuse, sabit bir basınç sağlamak için rezervuarı yeniden doldurun. Perfüzyondan sonra, kalp kapakçığını bir haftaya kadar kullanıma kadar dört santigrat derecede sabitleyici çözeltide saklayın.
Boyama için, sabit kalp kapak örneğini üç kez soğuk 0.15 molar kakadot tamponu ile beş dakika yıkayın ve kalp kapakçığını 1.5 potasyum ferrosiyanür, 0.15 molar kakadot, iki milimoler kalsiyum klorür ve% 2 osmiyum tetroksit çözeltisine bir saat boyunca tamamen batırın. Numuneleri oda sıcaklığında çift damıtılmış su ile hafif ajitasyon ile beş dakika boyunca bir tüpe yerleştirerek yıkayın. Üç yıkamadan sonra, numuneyi oda sıcaklığında filtrelenmiş tiyokarbohidrazid çözeltisine yerleştirin.
20 dakika sonra, numuneyi daha önce gösterildiği gibi suyla üç kez yıkayın. Daha sonra, numuneyi oda sıcaklığında% 2 osmiyum tetroksit içine yerleştirin. 30 dakika sonra, her biri beş dakika boyunca üç kez suyla yıkayın ve numuneyi dört santigrat derecede gece boyunca% 1 uranil asetat halinde kuluçkaya bırakın.
Bu arada, kurşun nitrat çözeltisi hazırlayın. Ertesi gün, daha önce gösterildiği gibi yıkama adımını üç kez gerçekleştirin, ardından kalp kapak dokusunu 30 dakika boyunca 60 santigrat derecede kurşun aspartat çözeltisinde kuluçkaya yatırın. Örnekleri üç kez daha yıkayın, ardından kalp kapak dokularında her biri beş dakika boyunca buz üzerinde taze hazırlanmış 20, 50, 70 ve% 90 etanol ile seri bir dehidrasyon tedavisi yapın ve ardından% 100 etanol ile iki sonraki tedavi.
Dehidrasyondan sonra, dokuları buz gibi asetona taşıyın, ardından 10 dakika boyunca oda sıcaklığında taze aseton içine yerleştirin. Gömme için reçine karışımını üreticinin özelliklerine göre yapın. Dokuları sonraki tedavilerde 25 ila 75, 50 ila 50 ve 75 ila 25 reçineyi aseton karışımına iki saat boyunca yerleştirin.
Son olarak, dokuları bir gecede% 100 reçineye yerleştirin. Ertesi gün, dokuları taze% 100 reçineye yerleştirin. İki saat sonra, dokuları gömme bir kapsüle aktarın, taze% 100 reçine ekleyin ve tedavi etmek için 48 saat boyunca 60 santigrat derecelik bir fırına yerleştirin.
Hidrostatik basıncın uygulanmasından önce ve sonra eksize edilmiş anastomozlu pulmoner arter burada gösterilmiştir. Pulmoner gövde, pulmoner valf broşürlerinin kapalı bir konfigürasyonda olduğunu gösteren radyal olarak distends. Mikro bilgisayarlı tomografi pulmoner kapak onayını doğruladı.
Broşürler kapatıldı ve annulus dairesel iken, fiksasyon veya arteriyel çökme ile çeşitli derecelerde yetersiz pulmoner kapak basınçlandırması gözlendi. Mikro CT ses işleme sanal kesitleri, dilimleme yönünü ve konumunu doğrulamak için optik görüntülerle ilişkilendirildi. Numune bloğu istenen yerde ve yöndeyken bir broşür içinde yerel bir bölgede yüksek çözünürlüklü SBF SEM görüntüleri çekildi.
Mikro CT ses düzeyi işleme sanal dilimi, düşük çözünürlüklü ve yüksek çözünürlüklü SBF SEM görüntüleri arasındaki ilişkili görüntüler burada gösterilmiştir. Pulmoner kapakçığın parçalı bir bölgesinin 3D gösteriminde endotel hücreleri, valvüler interstisyel hücreler ve hücre dışı lifler gibi hücre dışı bileşenler tanımlanabilir. Bu protokolü denerken, lütfen basınçlandırmanın gerçekleştirilmesinin kritik olduğunu ve verimin mümkün olduğunca yüksek olmasını sağlayacağını unutmayın.
