Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es dazu gedacht ist, Fragen zur Strukturfunktion der murinen Pulmonalklappe zu beantworten, die aufgrund ihrer inhärenten Heterogenität im Allgemeinen schwierig ist. Die kontrollierte Fixierung und korrelative Bildgebung wurden verwendet, um die Struktur auf mehreren Längenskalen zu erfassen. Lokale hochauflösende Bilder können dann wieder auf die genaue anatomische Stelle an der Pulmonalklappe abgebildet werden.
Dr. Tai Yi, Direktor der Mikrochirurgie im Zentrum für Regenerative Medizin am Nationwide Children's Hospital, wird das Verfahren demonstrieren. Beginnen Sie mit dem Autoklavieren der Werkzeuge, die für die Mausdissektion benötigt werden, einschließlich feiner Scheren, Mikrokraftmaschinen, mikrovaskulärer Klemmen, Zangenzangen, Mikronierenhalter, Federscheren und Retraktoren. Nachdem Sie eine erwachsene C57BL / 6-Maus eingeschläfert haben, legen Sie sie in eine dorsale Liegeposition auf ein Tablett, sichern Sie ihre Gliedmaßen mit Klebeband und führen Sie die Thorakotomie durch.
Setzen Sie das Herz frei, indem Sie überschüssiges Fettgewebe und Faszien entfernen, entfernen Sie dann den rechten Vorhof und perfundieren Sie den linken Ventrikel mit Kochsalzlösung bei Raumtemperatur. Entfernen Sie das gesamte Herz, indem Sie die obere Hohlvene, die Untervene, die Lungenarterie und die Aorta durchtrennen und etwa zwei Millimeter über der ventrikuloatrialen Verbindung schneiden, die als Kanal für die Druckbeaufschlagung dient. Entfernen Sie die linken und rechten Ventrikel, um die Kammern dem atmosphärischen Druck auszusetzen, und stellen Sie sicher, dass die Lungenstammstruktur durch entfernen der Ventrikel nicht beeinträchtigt wird.
Anastomose-Druckschlauch mit der Lungenarterie, wobei etwa ein Millimeter Abstand zwischen der sinotubulären Verbindung und dem Ende des Schlauches bleibt, um große Bewegungen der Blättchen und des Lungenstamms aufzunehmen. Heben Sie das Reservoir auf einen analogen physiologischen Druck und füllen Sie es mit der Kochsalzlösung. Testen Sie das Durchflusssystem, um sicherzustellen, dass keine Verstopfungen oder Luftblasen vorhanden sind.
Befestigen Sie einen Absperrhahn an der anastomosierten Pulmonalklappe und sorgen Sie durch Umschalten des Ausflusstraktes für einen ausreichenden Durchfluss durch den Schlauch. Sobald der Fluss ausreichend ist, schalten Sie den Abfluss auf die anastomosierte Pulmonalklappe um und stellen Sie die Druckbeaufschlagung des Lungenstamms sicher, der durch Rumpfdehnung identifiziert wird. Nach Bestätigung der Druckbeaufregung des Lungenstamms schrittweise primäre Fixierlösung einbauen, bis 25% der Reservoirkapazität der Kochsalzlösung gereinigt sind.
Legen Sie eine fixiermittelgetränkte Gaze über die Gewebeprobe, um ein Austrocknen zu verhindern. Halten Sie das Fixiermittel drei Stunden lang durch und füllen Sie das Reservoir auf, um einen konstanten Druck aufrechtzuerhalten. Nach der Perfusion die Herzklappe in der Fixierlösung bei vier Grad Celsius bis zu einer Woche lagern.
Zur Färbung die feste Herzklappenprobe dreimal mit kaltem 0,15 molarem Cacodylatpuffer für fünf Minuten waschen und die Herzklappe eine Stunde lang vollständig in eine Lösung aus 1,5 Kaliumferrocyanid, 0,15 Molarkacodylat, zwei millimolarem Calciumchlorid und 2% Osmiumtetroxid auf Eis tauchen. Waschen Sie die Proben mit doppelt destilliertem Wasser bei Raumtemperatur, indem Sie sie fünf Minuten lang unter leichtem Rühren in ein Röhrchen geben. Nach drei weiteren Wäschen wird die Probe in gefilterte Thiocarbohydrazidlösung bei Raumtemperatur geben.
Nach 20 Minuten waschen Sie die Probe dreimal mit Wasser, wie zuvor gezeigt. Als nächstes legen Sie die Probe in 2% Osmiumtetroxid bei Raumtemperatur. Nach 30 Minuten dreimal fünf Minuten lang mit Wasser waschen und die Probe über Nacht bei vier Grad Celsius in 1% Uranylacetat inkubieren.
Bereiten Sie in der Zwischenzeit eine Lösung von Bleinitrat vor. Führen Sie am nächsten Tag den Waschschritt dreimal durch, wie zuvor gezeigt, und inkubieren Sie dann das Herzklappengewebe in Bleiaspartatlösung bei 60 Grad Celsius für 30 Minuten. Waschen Sie die Proben noch drei weitere Male und führen Sie dann eine serielle Dehydratisierungsbehandlung an den Herzklappengeweben mit frisch zubereitetem 20, 50, 70 und 90% Ethanol auf Eis für jeweils fünf Minuten durch, gefolgt von zwei nachfolgenden Behandlungen mit 100% Ethanol.
Nach der Austrocknung das Gewebe zu eiskaltem Aceton bewegen und dann für 10 Minuten in frisches Aceton bei Raumtemperatur legen. Zum Einbetten die Harzmischung nach herstellerfüllendem Vorgabe herstellen. Legen Sie gewebe in nachfolgende Behandlungen von 25 bis 75, 50 bis 50 und 75 bis 25 Harz zu Acetonmischung für jeweils zwei Stunden.
Zum Schluss legen Sie das Gewebe über Nacht in 100% Harz. Am nächsten Tag legen Sie das Gewebe in frisches 100% Harz. Nach zwei Stunden das Gewebe in eine Einbettungskapsel geben, frisches 100% Harz hinzufügen und für 48 Stunden in einen 60 Grad Celsius ofen geben, um es auszuhärten.
Die herausgeschnittene anastomosierte Lungenarterie vor und nach der Anwendung von hydrostatischem Druck ist hier dargestellt. Der Lungenstamm dehnung sich radial, was darauf hinweist, dass sich die Lungenklappenblättchen in einer geschlossenen Konfiguration befinden. Die mikroberechnete Tomographie bestätigte die Bestätigung der Pulmonalklappe.
Die Blättchen waren geschlossen und der Ring war kreisförmig, während unterschiedliche Grade einer unzureichenden Druckbeaufschlagung der Pulmonalklappe durch Fixation oder arteriellen Kollaps beobachtet wurden. Das Mikro-CT-Volumen, das virtuelle Querschnitte rendert, wurde mit optischen Bildern korreliert, um die Schnittrichtung und -position zu bestätigen. Hochauflösende SBF-SEM-Bilder wurden in einer lokalen Region innerhalb eines Prospekts aufgenommen, wenn sich der Probenblock an der gewünschten Stelle und Ausrichtung befand.
Hier werden korrelierte Bilder zwischen dem Mikro-CT-Volumen, das virtuelle Slice-Bilder rendert, hochauflösenden und hochauflösenden SBF-SEM-Bildern gezeigt. In der 3D-Darstellung einer segmentierten Region der Pulmonalklappe können extrazelluläre Komponenten wie Endothelzellen, valvuläre interstitielle Zellen und extrazelluläre Fasern identifiziert werden. Wenn Sie dieses Protokoll versuchen, beachten Sie bitte, dass die Durchführung der Druckbeaufschlagung kritisch ist und sicherstellt, dass die Ausbeute so hoch wie möglich ist.
