La construcción de membranas bicapa lipídicas descritas en este protocolo se puede utilizar para obtener información crucial sobre las interacciones de la membrana con agentes farmacéuticos, tóxicos ambientales e incluso compuestos biológicos. Estas técnicas se pueden utilizar para fabricar membranas de complejidad líquida variable y para evaluar la permeabilidad, absorción e incrustación de compuestos dentro de las membranas. Para comenzar, agregue el volumen apropiado de solución de almacenamiento de lípidos en un vidrio limpio vil para lograr una concentración final de vesícula de 2.5 miligramos por mililitro después de la rehidratación.
Elimine el cloroformo de la solución lipídica, utilizando una corriente de gas nitrógeno. Para garantizar la eliminación completa del cloroformo, conecte la película lipídica seca al vacío durante al menos cuatro horas. Rehidrate la película lipídica seca con un volumen requerido de tampón de cloruro de sodio Tris para producir la concentración final de vesícula de 2.5 miligramos por mililitro, y vórtice durante aproximadamente 15 a 30 segundos.
Transfiera la suspensión de vesículas a un recipiente con hielo seco hasta que se congele durante aproximadamente 30 minutos. Después de que la muestra esté completamente congelada, descongele la suspensión en un baño de agua de 30 a 40 grados centígrados. Vórtice la suspensión de vesícula descongelada.
Para hacer un mililitro o menos de vesículas, obtenga una mini extrusora. Moje previamente un soporte de filtro con agua ultra pura, luego colóquelo en la superficie de soporte de la membrana dentro del anillo O. Repita para el segundo soporte de membrana interna.
Coloque un soporte de membrana interna en la carcasa exterior del extrusor. Coloque una membrana de policarbonato de 100 nanómetros sobre el soporte de la membrana interna directamente sobre el soporte del filtro. Coloque el segundo soporte de membrana interna en la carcasa exterior del extrusor con el anillo O y el lado de soporte del filtro frente a la membrana de policarbonato.
Fije el rodamiento de politetrafluoroetileno en el nudo de retención y atorníllelo cerrado con la carcasa exterior del extrusor. Enganche la extrusora en el bloque de calentamiento. Cargue la suspensión de vesícula lipídica en una de las jeringas y coloque la jeringa en el bloque de calor del extrusor, insertando la aguja completamente en un extremo del extrusor.
Inserte la segunda jeringa vacía en el lado opuesto y bloquee ambas jeringas con los clips para el brazo en el bloque de calor. Empuje lentamente la suspensión de la vesícula en la jeringa vacía y luego vuelva a la jeringa original. Repita 20 veces más para un total de 21 pasadas a través de la membrana de policarbonato.
Transfiera las vesículas lipídicas a un vidrio limpio vil para su almacenamiento. Para extruir de cinco a 50 mililitros de vesículas, ensamble la extrusora grande colocando el soporte de la pantalla de orificio grande, el disco centrado, los discos de drenaje y la membrana de policarbonato en el espacio en el soporte inferior del extrusor. Conecte los soportes superior e inferior de la extrusora con los cuatro tornillos y apriete.
Conecte la unidad extrusora al cilindro de muestra frotándola hasta la parte inferior y apretándola con una llave inglesa para asegurarla. Llene el cilindro de muestra con agua ultrapura y extruya el agua a través de la unidad extrusora antes de agregar la muestra al cilindro de muestra. Agregue la suspensión de vesícula lipídica en el cilindro de muestra y cierre la parte superior.
Aumente lentamente la presión hasta que la muestra comience a gotear desde la unidad extrusora a una velocidad de aproximadamente dos o tres gotas por segundo en un vidrio limpio vil. Una vez que toda la muestra haya sido extruida, apague el suministro de nitrógeno y libere la presión en el cilindro de muestra abriendo lentamente la válvula de alivio de presión. Vierta las vesículas lipídicas de nuevo en el cilindro de muestra y repita el paso anterior nueve veces más para un total de 10 extrusiones.
Cargue la suspensión de vesícula en la cubeta apropiada e insértela en el instrumento de dispersión dinámica de luz, ingrese los detalles de la muestra y realice la medición utilizando el software asociado. Coloque la celda zeta en la cámara de muestra, asegurándose de que los electrodos estén en contacto, y cierre la tapa del portamuestras. En el software asociado, ingrese los detalles de la muestra y recopile las mediciones.
Inserte el sensor de cristal de cuarzo codificado con sílice en el módulo de flujo, asegurándose de que la forma de T en el cristal se alinee con la forma de T en el módulo y cierre el módulo de flujo. En instrumentos con múltiples cámaras, se pueden formar bicapas adicionales en paralelo. Conecte el tubo de entrada y salida al módulo de flujo y a la bomba.
Coloque el tubo en los protectores de sujeción y cierre la tapa del sistema analizador. Coloque un contenedor de residuos en la salida de la bomba para recoger las soluciones gastadas. Para realizar la limpieza, primero encienda la bomba y ajuste la velocidad de flujo a 400 microlitros por minuto.
Inserte el tubo de entrada en agua ultra pura y fluya de cinco a 10 mililitros a través del módulo. Cambie el tubo a SDS y fluya de cinco a 10 mililitros a través del módulo. Vuelva a cambiar el tubo a agua ultra pura y fluya de 10 a 20 mililitros a través del módulo.
Finalmente, fluya el aire a través del módulo hasta que no se recoja ninguna solución restante. Retire el sensor del módulo de flujo y enjuague el sensor con agua ultra pura. Impulse el sensor y el módulo de flujo con una corriente de gas nitrógeno, asegurándose de que el electrodo siempre permanezca libre de cualquier líquido.
En una campana de humos químicos, inserte el sensor de cristal de cuarzo recubierto de sílice en un instrumento de limpieza ultravioleta u ozono. Encienda el instrumento y permita el tratamiento durante al menos dos minutos. Retire los sensores con cuidado y devuélvalos al módulo de flujo.
Encienda el instrumento analizador para conectar el software asociado y establecer la temperatura al valor deseado para formar la bicapa lipídica de apoyo. Permita que la temperatura se estabilice a la entrada deseada. Configure la medición y busque todas las frecuencias de resonancia del sensor, y la disipación para los sobretonos tres, cinco, siete, nueve, 11 y 13 antes de comenzar la medición.
Permita que el cloruro de sodio Tris fluya a través del módulo durante cinco a 10 minutos, asegurando que el cambio de frecuencia basal o Delta F y el cambio de disipación o los valores de Delta D en líquido permanezcan estables. Detenga la bomba, retire el tubo de entrada de la solución de cloruro de sodio Tris e insértelo cuidadosamente en la solución de vesícula lipídica. Reflujo durante cinco segundos para eliminar cualquier burbuja de aire del tubo de entrada y luego continuar el flujo hacia adelante.
Reinicie la medición en el software para poner a cero la línea base. Flujo de vesículas lipídicas hasta la formación de bicapa que se observa en tiempo real en el software de adquisición de datos. Luego repita este paso para cambiar el tubo de entrada de las vesículas lipídicas a un tampón de cloruro de sodio Tris.
Agregue cinco microlitros de la solución lipídica al compartimiento donante, que es una placa de filtro multipantalla de polivinilideno poroso 96 pozos con un tamaño de poro de 0,45 micrómetros. Sumerja inmediatamente la placa de filtro en el compartimento aceptor, que es una placa receptora de transporte que contiene 300 microlitros de solución salina tamponada con fosfato. Añadir 200 microlitros de solución salina tamponada con fosfato al compartimento del donante de transporte.
Siga los pasos anteriores para detener la bomba y cambiar el tubo de entrada a una solución de vesícula lipídica y observar la formación de bicapas, luego cambie el tubo de entrada en la solución alfa helicoidal o de péptido AH. Introduzca la solución en el módulo de flujo hasta que se observe el cambio de frecuencia y el cambio de disipación a partir de la nueva adición de solución. Detenga la bomba y deje que el péptido AH se incube con las vesículas durante 10 minutos.
Cambie el tubo de entrada a cloruro de sodio Tris e inicie el flujo para eliminar el péptido AH de las vesículas rotas, lo que lleva a la formación exitosa de una bicapa lipídica. Primero, fluya el disolvente de la molécula, luego, cambie el tubo de entrada a la solución que contiene la molécula de interés y fluya durante al menos cinco minutos. Si lo desea, detenga el flujo y permita que el líquido que contiene la molécula deseada se incube con la bicapa.
Cambie el tubo de entrada de nuevo a la molécula disolvente solo. Fluya durante al menos cinco minutos, luego cambie el tubo de entrada a cloruro de sodio Tris y fluya durante al menos cinco minutos. En el software, detenga la medición, guarde el archivo y detenga la bomba.
Inmediatamente después de los pasos anteriores para una bicapa suspendida unilipídica o para una bicapa suspendida multilipídica, retire el PBS del compartimiento de la placa del filtro donante y reemplácelo con 200 microlitros de la solución de prueba. Sumergirse inmediatamente en una nueva placa receptora de transporte con 300 microlitros de PBS. Después de la incubación con balanceo suave durante dos horas a 25 grados centígrados, recolecte 150 microlitros de la solución de los compartimentos donante y aceptor.
Medir la concentración de moléculas en ambas muestras utilizando un método apropiado basado en las propiedades de esta molécula. Se compararon el tamaño, la polidispersidad y el potencial Zeta de las vesículas PC de huevo unilipídicas y dos composiciones de vesículas multilipídicas. La distribución del tamaño de las vesículas PC del huevo y las vesículas multilipídicas fueron casi idénticas.
Tanto las vesículas de huevo como las de PC multilipídicas se cargaron negativamente, mientras que las vesículas multilipídicas de dos se cargaron positivamente. Las vesículas PC de huevo unilipídicas se absorben fácilmente en la superficie, como lo demuestra la disminución del cambio de frecuencia y el aumento del cambio de disipación, seguido de una ruptura espontánea. Las vesículas multilipídicas se absorben en la superficie, pero requieren la adición de péptido AH para romper las vesículas, lo que resulta en la formación de bicapa lipídica.
Con las bicapas lipídicas soportadas, el cambio de frecuencia y el cambio de disipación se pueden analizar antes y después de la introducción de un compuesto de interés. Por ejemplo, se investigaron las interacciones del DEHP y el tóxico ambiental con capas uni y multicapa soportadas. Se observaron niveles similares de absorción de DEHP para ambos tipos de bicapa lipídica.
Sin embargo, se observaron diferencias en el cambio de disipación entre las bicapas con un cambio de disipación mayor observado para la bicapa PC del huevo en comparación con la bicapa multilipídica. Se observó poca permeación para las bicapas uni-y multi-lipídicas una. Después de este procedimiento, se puede desarrollar una variedad de bicapas lipídicas que imitan a las células para permitir la detección libre de células de las interacciones moleculares con compuestos que van desde productos farmacéuticos hasta tóxicos ambientales.
