Los autores desean agradecer el apoyo de la Fundación Nacional de Investigación (NRF -NRFF2011-01 y NRF2015NRF-POC0001-19), el Consejo Nacional de Investigación Médica (NMRC / CBRG / 0005/2012), y la Universidad Tecnológica de Nanyang a NJC

1. Formación de admitidos bicapa lipídica sobre un soporte sólido hidrófilo <ol><li> Preparar soluciones de lípidos del stock de 10 mg / ml de 1,2-sn -glicero dioleoyl--3-fosfocolina (DOPC) y 1 mg / ml de 1,2-sn -glicero dioleoyl--3-phosphoethanolamine- N - (lisamina rodamina B sulfonil) (Rh-PE) por disolución de los polvos respectivos lípidos (apropiadamente pesó de antemano con una balance de masa analítica) en una solución de isopropanol. </li><li> Diluir y mezclar las soluciones madre en isopropanol a fin de preparar la mezcla de lípidos deseada a la concentración final. Para la microscopía de fluorescencia y FRAP experimentos, 0,5% en peso de Rh-PE debería incluirse en la mezcla de lípidos. </li><li> Inyectar la mezcla de lípidos en isopropanol en el canal microfluídico hasta que se llena. </li><li> Incubar la mezcla de lípidos en la superficie de vidrio durante aproximadamente 10 min. </li><li> Poco a poco reemplazar la solución de lípidos con una solución de agua o tampón usando una bomba peristáltica a un caudal muy bajo(10-50 l / min). Alternativamente, reemplace la mezcla de lípidos mediante pipeteo repetido. </li><li> Enjuague el canal a fondo con el exceso de tampón con el fin de eliminar el isopropanol residual. </li></ol> 2. La formación de membranas soportadas colesterol enriquecido Nota: La superficie sólida (SiO2) apoya la fusión de vesículas, pero la composición de la membrana (colesterol alto) inhibe la fusión de vesículas porque vesículas de colesterol enriquecido han doblado alta rigidez 30. <ol><li> Preparar una solución madre que contiene 10 mg / ml de lípidos DOPC, 10 mg / ml de colesterol, y 1 mg / ml Rh-PE disolviendo primero los polvos respectivos en isopropanol. </li><li> Repita los pasos 1,2 a 1,6 usando las soluciones madre preparadas en el paso 2.1. </li></ol> 3. Membrana Fluidez Ensayo <ol><li> Sumergir el portaobjetos de vidrio en solución de sodio dodecil sulfato (SDS) (1%) durante 10 min. </li><li> Se lavan los portas bien con agua desionizada y enjuague ingenioh etanol. </li><li> Blow-seca diapositivas utilizando una corriente suave de nitrógeno. </li><li> Exponer los portaobjetos a plasma de oxígeno durante 30 segundos a la máxima potencia de radiofrecuencia en la cámara de plasma de oxígeno. </li><li> Retire el revestimiento de película protectora del fondo comercial cámara de microfluidos (Figura 1A), utilizando una pinza y coloque la placa de vidrio sobre la cara adhesiva de la cámara (Figura 1B). </li><li> Montar los conectores y tubos en las posiciones de entrada y de salida de la cámara y coloque el canal microfluídico en la platina del microscopio (Figura 1C). </li><li> Formar una bicapa lipídica marcado fluorescentemente apoyado en el canal microfluídico [repita el paso 1 usando la composición lipídica deseado (por ejemplo, 0,5 mg / ml DOPC), incluyendo 0,5% en peso de Rh-PE en un disolvente orgánico]. </li><li> Localice el plano bicapa con un objetivo de inmersión en aceite de 60X (NA 1.49) con el fin de capturar imágenes. </li><li> Tome dos imágenes antes de la lejía, a continuación, la foto-Bleach 301; m mancha circular de ancho, con un haz de láser 532 mW nm, 100. Antes de photobleaching, calentar el láser hasta que su intensidad se ha convertido estable. Inmediatamente después de photobleaching, capturar una serie de imágenes cada 1 s durante 2 min con el fin de seguir la recuperación de la intensidad de fluorescencia en el lugar blanqueada. </li></ol> Ensayo Cuantificación 4. Colesterol <ol><li> Exponer el chip sensor revestido de cristal de cuarzo-dióxido de silicio a plasma de oxígeno durante 30 segundos a la máxima potencia de radiofrecuencia en la cámara de plasma de oxígeno. Retirar el chip de la cámara y de inmediato montar el chip en la cámara de medición. </li><li> Antes de experimento, primero adquirir la frecuencia y la disipación del chip sensor en el aire con el fin de asegurar el montaje correcto. <ol><li> Para el instrumento Q-Sense E1 o E4 QCM-D comercial, ejecute el programa de software Q-Soft y haga clic en &quot;Adquisición&quot; y seleccione &quot;Medición de configuración&quot;. </li><li> En la nueva ventana que aparece, marque el 3, 5, 7, 9, 11 y 13 matices y luego haga clic en Buscar y Ejecutar el fin de comprobar los espectros de resonancia. Ajuste la temperatura a 24 DO. Si una o más frecuencias de resonancia no están de acuerdo con los valores esperados, revise el chip de montaje y vuelva a realizar este paso hasta que se alcance un acuerdo. </li></ol></li><li> Arrancar la bomba peristáltica y el flujo de solución tampón (Tris 10 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5) en la cámara de medición a una velocidad de flujo de 100 l / min. </li><li> En el programa de software, haga clic en &quot;Adquisición&quot; y seleccione &quot;Medición Reiniciar&quot; para registrar las señales de disipación de frecuencia de resonancia y la energía. Repita este paso hasta que se obtiene una línea de base estable para los desplazamientos de frecuencia y la disipación. Nota: Para ver los pasos de aquí en adelante, no habrá cambios de frecuencia y de disipación adicionales que se pueden grabar en función del tiempo. </li><li> Inyectar isopropanol (sin lípido) durante 10 min. </li><li> Se inyecta la mezcla de lípidos DOPC / colesterol en larelación molar deseada con una concentración lipídica total de 0,5 mg / ml en isopropanol durante 10 min. </li><li> Inyectar tampón durante 20 min a un caudal de 100 l / min. </li><li> Inyectar una solución de 1 mM metil-β-ciclodextrina (MβCD) preparado en tampón (caudal 100 l / min) hasta que la señal de frecuencia alcanza un valor estable. </li><li> Medir los desplazamientos de frecuencia positivos relativos que es causada por la etapa de tratamiento MβCD y calcular la masa de colesterol y DOPC lípidos mediante la conversión de los valores? F cho y Df DOPC a los valores de masa mediante el uso de la ecuación de Sauerbrey [Delta M = - (C / N) x ? f, donde C = 17,7 ng / cm 2, n: sobretono]. </li><li> Calcular la fracción molar de colesterol en el SLB, teniendo en cuenta los pesos moleculares de los lípidos DOPC (786,1 g / mol) y colesterol (386,6 g / mol). </li></ol>

The authors have no competing financial interests to disclose.

En este trabajo, un protocolo de intercambio de disolvente se presenta en el cual los lípidos en alcohol (isopropanol, etanol o n-propanol) se incuban con un soporte sólido y luego el alcohol se sustituye gradualmente con una solución tampón acuosa con el fin de conducir una serie de transiciones de fase con el tiempo producir bicapas lipídicas laminares de fase 24. Se muestra que el método permite la fabricación de bicapas lipídicas soportadas en superficies tales como oro, que es intratable con el método de la fusión de vesículas. Un intervalo de concentración de lípidos óptima (0,1 - 0.5 mg / ml) se ha determinado para la formación de bicapa completa en formatos estándar experimentales ensayadas hasta el momento. A concentraciones de lípidos por debajo de 0,1 mg / ml, discretos parches, microscópicas de bicapas formado. Por otra parte, a concentraciones superiores a 0,1 mg / ml y menor que 0,5 mg / ml, se forma una bicapa completa y uniforme. A concentraciones de lípidos por encima de este rango, una bicapa fluida todavía estaba formada como verified por análisis FRAP, sin embargo, la microscopía de fluorescencia revela la presencia de estructuras de lípidos adicionales en la parte superior de la bicapa. Sorprendentemente, la morfología de estas estructuras de lípidos adicionales, tal como se determina por análisis de QCM-D, dependía del alcohol que se usó durante la etapa de incubación. En el caso del etanol, las relativamente altas turnos F y Δ D delta se asemejan a la firma QCM-D obtenido para una capa de vesículas adsorbido. Cuando se utilizó en lugar isopropanol o n-propanol, el Δ f fue ligeramente mayor que el valor esperado para una bicapa (Δ f final entre -30 a -40 Hz), mientras que el Δ D era apreciablemente mayor. Tales respuestas QCM-D se espera para las estructuras de lípidos prolongados (por ejemplo, micelas similares a gusanos) que sobresalen hacia fuera desde la superficie de la membrana (tan visibles por microscopía de fluorescencia en algunos casos). La tasa de cambio de disolvente es otro parámetro importante que puede ser crítico, especially cuando se utilizan concentraciones de lípidos inferiores (por ejemplo, 0,1 mg / ml). Cambio rápido disolvente a baja concentración de lípidos puede conducir a la formación de bicapas incompletos. En la cámara de medida estándar utilizada para mediciones QCM-D en este trabajo (cámara de medición Q-Sense E4), las tasas de flujo de alrededor de 100 l / min, eran adecuados para la formación de bicapa completa altamente reproducible. Para las células de flujo con otras geometrías y el volumen, la velocidad de flujo óptima puede variar y debe ser determinada empíricamente basado en los pasos sugeridos en el presente documento. Además de formar bicapas lipídicas soportadas en superficies que son intratables a la fusión de vesículas, la SALB se puede emplear para eludir la necesidad de vesículas lipídicas que puede romperse, abriendo así la puerta a la fabricación de membranas apoyadas con composiciones complejas. Como un ejemplo ilustrativo composición, se examinaron mezclas de lípidos con una alta fracción de colesterol. El colesterol es un componente importante de mammalian las membranas celulares, y su fracción de 45-50 pueden acercarse mol% de la composición lipídica de la membrana (por ejemplo, en los eritrocitos). Por lo tanto, incluso un modelo simple de una bicapa lipídica que representa una membrana de célula humana debe incluir colesterol. Mientras que la fusión de vesículas podría ser utilizado para fabricar las bicapas lipídicas de fluidos que contienen sólo el 10-15% de colesterol, el método permite SALB formación de bicapas lipídicas de fluidos que contienen altas fracciones de colesterol (hasta 57% en moles, tal como se cuantifica por medio de mediciones QCM-D) 36. Sin embargo, cuando el nivel de colesterol se elevó aún más (hasta 63% en moles), se observaron los dominios de la raya con forma 37. Los dominios coexistentes eran líquidas, que recuerda a los observados en la región β en el diagrama de fases de la monocapa de colesterol / fosfolípidos en la interfase aire-agua. En general, el método SALB se demuestra que es un enfoque simple y eficiente para formar bicapas lipídicas soportadas, especialmente in casos más allá del alcance del método de la fusión de vesículas convencionales. Hasta ahora, la técnica y la microscopía de fluorescencia QCM-D se utilizan principalmente para caracterizar las bicapas lipídicas apoyados formados por el método SALB. Mirando hacia adelante, una amplia gama de mediciones analíticas técnicas sensibles de superficie, incluyendo resonancia de plasmón superficial (SPR) 38, microscopía de fuerza atómica (AFM) 39,40, transformada de Fourier espectroscopia infrarroja 41, de rayos X 42 y la reflectividad de neutrones 43 puede, ser utilizado para caracterizar y estudiar configuraciones bicapa simples y complejas preparan por el método SALB. Estas capacidades emergentes abren la puerta a un mayor número de científicos que pueden explorar las membranas celulares artificiales mediante el aprovechamiento de un protocolo experimental sencillo y robusto.

El soporte sólido bicapa lipídica 1 (SLB) es una plataforma versátil que conserva las características básicas de las biomembranas tales como el espesor de bicapa, difusividad de los lípidos de dos dimensiones, y la capacidad de alojar biomoléculas asociadas a la membrana. Debido a la complejidad de las membranas celulares naturales, esta plataforma sencilla se ha demostrado que funcionan como una plataforma eficiente para los estudios in vitro de los procesos relacionados con la membrana como la formación de balsa 2, proteína de unión 3, virus y vinculante partícula de virus-like 4,5 y señalización celular 6. Formado en las proximidades de un soporte sólido, la plataforma SLB es compatible con una amplia gama de técnicas de mediciones sensibles de superficie tales como microscopía de reflexión interna total de (TIRF), microbalanza de cristal de cuarzo de disipación (QCM-D), y la espectroscopia de impedancia. Varios métodos han sido desarrollados para producir diferentes tipos de SLBS, incluyendo burbuja de airecolapso 7 y dip-pen nanolitografía 8 para las manchas de lípidos de tamaño submicrónico, spin-coating 9 para pilas bicapa y Langmuir-Blodgett (LB) 10 y la fusión de vesículas (VF) 11 para-que abarca por completo, recubrimientos individuales bicapa lipídica. El método VF consiste en la adsorción de pequeñas vesículas unilamelares a un soporte sólido y ruptura espontánea posterior y la fusión para formar una bicapa lipídica continua. Sin embargo, bajo condiciones fisiológicas, la rotura espontánea de vesículas se limita principalmente a los materiales basados ​​en silicio, tales como dióxido de silicio, vidrio y mica. Además, la rotura de la vesícula no se produce de forma espontánea para vesículas de lípidos complejos de composiciones tales como los que contienen altas fracciones de colesterol o lípidos cargados negativamente. Dependiendo del sistema, la ruptura de la vesícula puede ser inducida por la adaptación aún más las condiciones experimentales tales como la temperatura 12, la solución de pH 13, 14 y la salinidad, choque osmótico 15 </sup&gt; o presión 16, o la adición de iones divalentes tales como Ca 2 + 17. Alternativamente, el péptido AH-membrana activa se puede introducir con el fin de desestabilizar una capa de vesículas adsorbidos, lo que lleva a la ruptura de la vesícula y la formación de bicapa en una gama de superficies 18-22. Por otra parte, la formación de bicapa exitosa requiere la preparación de una población bien controlada de pequeñas vesículas unilamelares que puede llevar mucho tiempo y difícil de lograr para ciertas composiciones de membrana. Por lo tanto, a pesar de su alta eficiencia en casos óptimos (por ejemplo, después de una extensa pretratamiento de congelación-descongelación de vesículas 23), la aplicación general de la fusión de vesículas está limitada por el alcance de sustratos adecuados y composiciones de membrana. El método disolvente asistida bicapa lipídica (SALB) 24-28 de es una técnica de fabricación alternativa que no requiere vesículas lipídicas. El método se basa en la deposición of moléculas de lípidos sobre una superficie sólida en presencia de un disolvente orgánico miscible en agua, seguido por intercambio gradual de este disolvente con una solución tampón acuosa con el fin de desencadenar la formación SLB. Durante la etapa de intercambio de disolvente, la mezcla ternaria de lípidos, disolvente orgánico, y el agua se somete a una serie de transiciones de fase con el aumento de la fracción de agua, que conduce a la formación de estructuras de fase lamelar en la solución a granel y un SLB en el sustrato sólido. Es importante destacar que esta ruta auto-ensamblaje evita la necesidad de ruptura de la vesícula, que suele ser la etapa limitante para la transformación de vesículas adsorbidos en un SLB. El protocolo es aplicable a una amplia variedad de superficies, incluyendo dióxido de silicio, óxido de aluminio, cromo, óxido de indio y estaño, y oro. En este documento y en el vídeo que acompaña, se presenta una comparación de la deposición de lípidos por el SALB y métodos de fusión de vesículas. En particular, la concentración de lípidos de la influencia de los parámetros experimentales, incluyendo, Se discuten velocidad de flujo, y la elección de disolvente orgánico miscible agua, en la calidad de la bicapa formada por el método SALB. Caracterización analítica de los SLBS fabricadas se lleva a cabo por el QCM-D, microscopía de fluorescencia, y la recuperación después de fluorescencia photobleaching (FRAP) técnicas. Monitoreo QCM-D es una técnica de medición sensible a la masa de la superficie que, desde el trabajo pionero conducido por Keller y Kasemo 29, se ha utilizado ampliamente para investigar cuantitativamente formación de bicapa. Microscopía de fluorescencia permite la inspección de la homogeneidad de la membrana, así como la visualización de los dominios de membrana. La técnica FRAP es una herramienta estándar para determinar la movilidad lateral de moléculas de lípidos en un SLB, que es una propiedad esencial de las membranas de fluidos. La primera parte de este estudio implica el análisis QCM-D de la SALB y métodos de fusión de vesículas aplicado para intentar formación de bicapa en dióxido de silicio y el oro. En la segunda parte,la preparación y caracterización de las membranas soportado que contiene un rango de concentraciones de colesterol con el método SALB se demuestran y los resultados se compararon con los obtenidos por el método de la fusión de vesículas.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1459">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">QCM-D silicon dioxide-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">QCM-D gold-coated substrates</td>
			<td style="width:356px;">QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Sense E4 module</td>
			<td>QSense AB,&#160; Sweden</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;">Plasma Cleaner, PDC-32G</td>
			<td>Harrick Plasma, Ithaca, NY</td>
			<td>PDC-001 (115V)&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DOPC)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>850375P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(lissamine rhodamine B sulfonyl) (ammonium salt) (Rh-PE)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td>810150P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids</td>
			<td style="width:217px;">700000P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Methyl-&#946;-cyclodextrin</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td style="width:217px;">C4555</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Isopropanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">673773</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Ethanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">459844</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">n-propanol</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right">279544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sticky-Slide I 0.1 Luer</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">81128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Male elbow 1/8&#8221;</td>
			<td style="width:356px;">Cole-Parmer</td>
			<td style="width:217px;">30505-70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Silicon tubing 1.6mm ID</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Glass coverslip No. 1.5H, 25 mm x 75 mm</td>
			<td style="width:356px;">IBIDI</td>
			<td align="right" style="width:217px;">10812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Reglo Digital M2-2/12 Peristaltic Pump</td>
			<td style="width:356px;">Ismatec</td>
			<td style="width:217px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:719px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:356px;">Sigma&#160;</td>
			<td align="right" style="width:217px;">71725</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

biomembrane fabrication by the solvent-assisted lipid bilayer (salb) method

Con el fin de imitar las membranas celulares, la bicapa lipídica apoyado (SLB) es una plataforma atractiva que permite en la investigación in vitro de los procesos relacionados con la membrana, mientras que confiere biocompatibilidad y biofuncionalidad a sustratos sólidos. La adsorción espontánea y la ruptura de las vesículas de fosfolípidos es el método más comúnmente utilizado para formar SLBS. Sin embargo, bajo condiciones fisiológicas, la fusión de vesículas (VF) se limita a sólo un subconjunto de composiciones lipídicas y soportes sólidos. Aquí se describe un procedimiento general de un solo paso llamado el método de formación de disolvente con ayuda de bicapa lipídica (SALB) con el fin de formar SLBS que no requiere vesículas. El método SALB implica la deposición de moléculas de lípidos sobre una superficie sólida en presencia de disolventes orgánicos miscibles en agua (por ejemplo, isopropanol) y de intercambio de disolvente posterior con solución tampón acuosa con el fin de desencadenar la formación SLB. La etapa de intercambio de disolvente continuo permite la aplicación de lamétodo en una configuración de flujo pasante adecuada para la formación de monitoreo bicapa y subsiguientes alteraciones utilizando una amplia gama de biosensores sensibles a la superficie. El método SALB se puede utilizar para fabricar SLBS en una amplia gama de superficies sólidas hidrófilas, incluyendo aquellos que son intratables a la fusión de vesículas. Además, permite la fabricación de SLBS compuestas de composiciones lipídicas que no se pueden preparar utilizando el método de la fusión de vesículas. En este documento, se comparan los resultados obtenidos con los métodos de fusión de vesículas SALB y convencionales sobre dos superficies hidrófilas ilustrativos, dióxido de silicio y el oro. Para optimizar las condiciones experimentales para la preparación de bicapas de alta calidad preparadas a través del método SALB, el efecto de varios parámetros, incluyendo el tipo de disolvente orgánico en la etapa de deposición, la tasa de intercambio de disolvente, y la concentración de lípidos se discute junto con sugerencias para solucionar problemas . Formación de apoyo a las membranas que contienen altas fracciones de colesterol es también demoniostrado con el método SALB, destacando las capacidades técnicas de la técnica SALB para una amplia gama de configuraciones de membrana.

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Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

Se presenta un protocolo experimental para formar una bicapa lipídica apoyado sobre soportes sólidos sin usar vesículas lipídicas. Se demuestra un método de un solo paso para formar una bicapa lipídica en dióxido de silicio y oro, así como membranas soportadas con dominio enriquecida en colesterol para diversas aplicaciones biológicas.

Biomembrana Fabrication por la bicapa lipídica (SALB) Método-Solvente asistida

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

14.6K vistas.  Nanyang Technological University.  Se presenta un protocolo experimental para formar una bicapa lipídica apoyado sobre soportes sólidos sin usar vesículas lipídicas. Se demuestra un método de un solo paso para formar una bicapa lipídica en dióxido de silicio y oro, así como membranas soportadas con dominio enriquecida en colesterol para diversas aplicaciones biológicas. 

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Constant Pressure-controlled Extrusion Method for the Preparation of Nano-sized Lipid Vesicles

Liposomes are artificially prepared vesicles consisting of natural and synthetic phospholipids that are widely used as a cell membrane mimicking platform to study protein-protein and protein-lipid interactions3, monitor drug delivery4,5, and encapsulation4. Phospholipids naturally create curved lipid bilayers, distinguishing itself from a micelle.6 Liposomes are traditionally classified by size and number of bilayers, i.e. large unilamellar vesicles (LUVs), small unilamellar vesicles (SUVs) and multilamellar vesicles (MLVs)7. In particular, the preparation of homogeneous liposomes of various sizes is important for studying membrane curvature that plays a vital role in cell signaling, endo- and exocytosis, membrane fusion, and protein trafficking8. Several groups analyze how proteins are used to modulate processes that involve membrane curvature and thus prepare liposomes of diameters &lt;100 - 400 nm to study their behavior on cell functions3. Others focus on liposome-drug encapsulation, studying liposomes as vehicles to carry and deliver a drug of interest9. Drug encapsulation can be achieved as reported during liposome formation9. Our extrusion step should not affect the encapsulated drug for two reasons, i.e. (1) drug encapsulation should be achieved prior to this step and (2) liposomes should retain their natural biophysical stability, securely carrying the drug in the aqueous core. These research goals further suggest the need for an optimized method to design stable sub-micron lipid vesicles.
Nonetheless, the current liposome preparation technologies (sonication10, freeze-and-thaw10, sedimentation) do not allow preparation of liposomes with highly curved surface (i.e. diameter &lt;100 nm) with high consistency and efficiency10,5, which limits the biophysical studies of an emerging field of membrane curvature sensing. Herein, we present a robust preparation method for a variety of biologically relevant liposomes.
Manual extrusion using gas-tight syringes and polycarbonate membranes10,5 is a common practice but heterogeneity is often observed when using pore sizes &lt;100 nm due to due to variability of manual pressure applied. We employed a constant pressure-controlled extrusion apparatus to prepare synthetic liposomes whose diameters range between 30 and 400 nm. Dynamic light scattering (DLS)10, electron microscopy11 and nanoparticle tracking analysis (NTA)12 were used to quantify the liposome sizes as described in our protocol, with commercial polystyrene (PS) beads used as a calibration standard. A near linear correlation was observed between the employed pore sizes and the experimentally determined liposomes, indicating high fidelity of our pressure-controlled liposome preparation method. Further, we have shown that this lipid vesicle preparation method is generally applicable, independent of various liposome sizes. Lastly, we have also demonstrated in a time course study that these prepared liposomes were stable for up to 16 hours. A representative nano-sized liposome preparation protocol is demonstrated below.

This protocol describes an extrusion method for preparing lipid vesicles of sub-micron sizes with a high degree of homogeneity. This method uses a pressure-controlled system with controlled nitrogen flow rates for liposome preparation. The lipid preparation1,2, liposome extrusion, and size characterization will be presented herein.

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Formation of Biomembrane Microarrays with a Squeegee-based Assembly Method

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are heterogeneous mixtures of many types of lipids, contain membrane-bound proteins and are decorated with carbohydrates. In some experiments, it is desirable to decouple the biophysical or biochemical properties of the lipid bilayer from those of the natural membrane. Such cases call for the use of model systems such as giant vesicles, liposomes or supported lipid bilayers (SLBs). Arrays of SLBs are particularly attractive for sensing applications and mimicking cell-cell interactions. Here we describe a new method for forming SLB arrays. Submicron-diameter SiO2 beads are first coated with lipid bilayers to form spherical SLBs (SSLBs). The beads are then deposited into an array of micro-fabricated submicron-diameter microwells. The preparation technique uses a "squeegee" to clean the substrate surface, while leaving behind SSLBs that have settled into microwells. This method requires no chemical modification of the microwell substrate, nor any particular targeting ligands on the SSLB. Microwells are occupied by single beads because the well diameter is tuned to be just larger than the bead diameter. Typically, more 75% of the wells are occupied, while the rest remain empty. In buffer SSLB arrays display long-term stability of greater than one week. Multiple types of SSLBs can be placed in a single array by serial deposition, and the arrays can be used for sensing, which we demonstrate by characterizing the interaction of cholera toxin with ganglioside GM1. We also show that phospholipid vesicles without the bead supports and biomembranes from cellular sources can be arrayed with the same method and cell-specific membrane lipids can be identified.

Supported lipid bilayers and natural membrane particles are convenient systems that can approximate the properties of cell membranes and be incorporated in a variety of analytical strategies. Here we demonstrate a method for preparing microarrays composed of supported lipid bilayer-coated SiO2 beads, phospholipid vesicles or natural membrane particles.

Formación de biomembrana Microarrays con un método basado en la Asamblea Rasero

Lipid bilayer membranes form the plasma membranes of cells and define the boundaries of subcellular organelles. In nature, these membranes are ...

Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This emerging field engages engineers, chemists, biologists, and physicists to design and assemble basic biological components into complex, functioning systems from the bottom up. Such bottom-up systems could lead to the development of artificial cells for fundamental biological inquiries and innovative therapies1,2. Giant unilamellar vesicles (GUVs) can serve as a model platform for synthetic biology due to their cell-like membrane structure and size. Microfluidic jetting, or microjetting, is a technique that allows for the generation of GUVs with controlled size, membrane composition, transmembrane protein incorporation, and encapsulation3. The basic principle of this method is the use of multiple, high-frequency fluid pulses generated by a piezo-actuated inkjet device to deform a suspended lipid bilayer into a GUV. The process is akin to blowing soap bubbles from a soap film. By varying the composition of the jetted solution, the composition of the encompassing solution, and/or the components included in the bilayer, researchers can apply this technique to create customized vesicles. This paper describes the procedure to generate simple vesicles from a droplet interface bilayer by microjetting.

Microfluidic jetting against a droplet interface lipid bilayer provides a reliable way to generate vesicles with control over membrane asymmetry, incorporation of transmembrane proteins, and encapsulation of material. This technique can be applied to study a variety of biological systems where compartmentalized biomolecules are desired.

Lípidos bicapa vesículas Generación Usando Microfluidic Jetting

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

Polymeric Microneedle Array Fabrication by Photolithography

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a photomask consisting of embedded micro-lenses. Embedded micro-lenses were found to influence MN geometry (sharpness). Robust MN arrays with tip diameters ranging between 41.5 &#181;m &#177; 8.4 &#181;m and 71.6 &#181;m &#177; 13.7 &#181;m, with two different lengths (1,336 &#181;m &#177; 193 &#181;m and 957 &#181;m &#177; 171 &#181;m) were fabricated. These MN arrays may provide potential applications in delivery of low molecular and macromolecular therapeutic agents through skin.

Here, we present a protocol describing a mold-free fabrication process of the polymeric microneedles by photolithography.

Fabrication polimérico matriz de microagujas por fotolitografía

This manuscript describes the fabrication of polymeric microneedle (MN) arrays by photolithography. It involves a simple mold-free process by using a ...

Solid Lipid Nanoparticles (SLNs) for Intracellular Targeting Applications

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter cellular signaling and gene expression. In a previous investigation, the synthesis of ultra-small solid lipid nanoparticles (SLNs) for topical drug delivery and biomarker detection applications was demonstrated. SLNs are a well-studied example of a nanoparticle delivery system that has emerged as a promising drug delivery vehicle. In this study, SLNs were loaded with a fluorescent dye and used as a model to investigate particle-cell interactions. The phase inversion temperature (PIT) method was used for the synthesis of ultra-small populations of biocompatible nanoparticles. A 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenylphenyltetrazolium bromide (MTT) assay was utilized in order to establish appropriate dosing levels prior to the nanoparticle-cell interaction studies. Furthermore, primary human dermal fibroblasts and mouse dendritic cells were exposed to dye-loaded SLN over time and the interactions with respect to toxicity and particle uptake were characterized using fluorescence microscopy and flow cytometry. This study demonstrated that ultra-small SLNs, as a nanoparticle delivery system, are suitable for intracellular targeting of different cell types.

Solid Lipid Nanoparticles SLNs for Intracellular Targeting Applications

In this study, a method for synthesizing ultra-small populations of biocompatible nanoparticles was described, as well as several in vitro methods by which to assess their cellular interactions.

Sólido lípidos nanopartículas (GLC) Aplicaciones para intracelular de focalización

Nanoparticle-based delivery vehicles have shown great promise for intracellular targeting applications, providing a mechanism to specifically alter ...

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

Formación Automated bicapa lipídica membrana utilizando un polidimetilsiloxano Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

Arrays Ligando Nano-racimo en un Apoyado bicapa lipídica

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

A Simple and Scalable Fabrication Method for Organic Electronic Devices on Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices cannot be worn under everyday conditions. Therefore, textiles are commonly considered the best substrate to accommodate electronic devices in wearable use. In this paper, we describe how to selectively pattern organic electroactive materials on textiles from a solution in an easy and scalable manner. This versatile deposition technique enables the fabrication of wearable organic electronic devices on clothes.

In this paper, we present a protocol to selectively deposit organic materials on textiles, which allows for the direct integration of organic electronic devices with wearables. The fabricated devices can be fully integrated in textiles, respecting their mechanical appearance and enabling sensing capabilities.

Un método de fabricación simple y escalable para dispositivos electrónicos orgánicos sobre los Textiles

Today, wearable electronics devices combine a large variety of functional, stretchable, and flexible technologies. However, in many cases, these devices ...

Fabrication of Decellularized Cartilage-derived Matrix Scaffolds

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage research has focused on the development of regenerative scaffolds. This article describes the development of scaffolds that are completely derived from natural cartilage extracellular matrix, coming from an equine donor. Potential applications of the scaffolds include producing allografts for cartilage repair, serving as a scaffold for osteochondral tissue engineering, and providing in vitro models to study tissue formation. By decellularizing the tissue, the donor cells are removed, but many of the natural bioactive cues are thought to be retained. The main advantage of using such a natural scaffold in comparison to a synthetically produced scaffold is that no further functionalization of polymers is required to drive osteochondral tissue regeneration. The cartilage-derived matrix scaffolds can be used for bone and cartilage tissue regeneration in both in vivo and in vitro settings.

Decellularized cartilage-derived scaffolds can be used as a scaffold to guide cartilage repair and as a means to regenerate osteochondral tissue. This paper describes the decellularization process in detail and provides suggestions to use these scaffolds in in vitro settings.

Fabricación de andamios de Decellularized derivados de cartílago matriz

Osteochondral defects lack sufficient intrinsic repair capacity to regenerate functionally sound bone and cartilage tissue. To this extent, cartilage ...