Este trabajo fue apoyado por la Sociedad Max Planck, el Centro Alemán de Investigación Oncológica, la Universidad de Tubinga, y el Bundesministerium für Bildung und Forschung (subvención. No 0312040). Damos las gracias a Eduard Hermann por ayudarnos a automatizar el análisis de los datos de la curva de la fuerza y ​​el Dr. Jakob Suckale para una lectura cuidadosa de este manuscrito.

1. Preparación de admitidos Bilayers lípidos (SLB) 11,12,21 <ol><li> Preparación de mezcla de lípidos y vesículas multilamelares Suspensiones <ol><li> Prepare los siguientes tampones de antemano. <ol><li> Preparar tampón PBS en concentraciones de 2,7 mM KCl, 1,5 mM KH 2 PO 4, 8 mM Na 2 HPO 4, y NaCl 137 mM, pH 7,2. </li><li> Preparar SLB (bicapa lipídica apoyado) tampón a concentraciones de NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,4. </li><li> Preparar una solución de 1 M de CaCl2. </li></ol></li><li> Disolver los siguientes lípidos en cloroformo a una concentración deseada: por ejemplo, di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC) a 25 mg / ml, esfingomielina (SM) a 25 mg / ml y colesterol (Chol) a 10 mg / ml. </li><li> Tome 18,38 l de DOPC, 17,10 l de SM y 11,30 l de Chol para hacer una solución con 1 mg de lípidos totales en un 2: 2: 1 DOPC: relación molar Chol: SM. Varíe los volúmenes de acuerdo basado en el concentrations de los lípidos preparados en 1.1.2. Sin embargo, mantener la relación molar a 2: 2: 1 DOPC: SM: Chol, como el cambio de la relación molar va a cambiar las características de fase de la membrana 25. </li><li> Mezclar la solución por completo mediante agitación. Añadir un colorante fluorescente lipídico en 0,05% en moles si se desea visualizar la bicapa por un microscopio de fluorescencia. Nota: La familia de dialkylcarbocyanines de cadena larga, como lo hizo, Dil y Dio abarcan una amplia gama de longitudes de onda y puede ser idealmente utilizan para etiquetar las membranas lipídicas. Alternativamente, los lípidos marcados con fluorescencia, como rodamina-fosfatidiletanolamina o BODIPY-colesterol pueden ser utilizados. En cualquier caso, la concentración del colorante debe ser optimizado de acuerdo con el ajuste de la microscopía, teniendo en cuenta que las altas concentraciones de fluoróforo unido al lípido puede cambiar el comportamiento de lípidos 19. </li><li> Seque el cloroformo utilizando gas N2 (o cualquier gas inerte disponibles, tales como Ar y He). </li><li> Además t secaque lipídico mezcla al vacío durante al menos 1 hora. Nota: Si va a guardar esta mezcla de lípidos, purgar el aire con gas inerte (N2, Ar o He) y almacenar a -20 ° C. Alícuota exceso de lípidos-en-cloroformo en pequeños frascos marrones. Secar en una manera similar a la mezcla de lípidos, desplazar el aire con gas inerte (N 2, Ar o He) y almacenar a -20 ° C. </li><li> Disolver los lípidos secos en tampón de PBS a una concentración de 10 mg / ml. </li><li> Vortex la mezcla vigorosamente durante aproximadamente 20 segundos a 1 minuto para obtener una suspensión turbia, contiene vesículas multilamelares. Asegúrese de que el no hay películas lipídicas se pegan a los lados del vial. </li><li> Distribuir esta suspensión en 10 alícuotas (1 mg de lípidos hace 10 alícuotas). </li><li> Almacenar a -20 ° C hasta su uso posterior. </li></ol></li><li> Preparación de vesículas unilamelares Nota: Los varios tamaños de vesículas unilamelares se pueden preparar utilizando el método de sonicación o el método de extrusión. Sonicación usa sound energía para agitar la mezcla y separar las capas de la suspensión multilamelares. Esto se indica en la limpieza de la suspensión turbia. Extrusión obliga a las vesículas multilamelares que pasar por un filtro de membrana con un tamaño de poro definido. <ol><li> Método Sonicación <ol><li> Tome los 10 l de suspensiones lipídicas multilamelares y añadir 150 l de tampón SLB. </li><li> Transfiera la mezcla en pequeñas (2 ml) viales de vidrio tapados y sellar con Parafilm. </li><li> Sonicar la mezcla a temperatura ambiente en un baño de ultrasonidos durante 10 min o hasta que se vuelve claro para producir pequeñas vesículas unilaminares (SUVs, por debajo de 50 nm de diámetro). </li></ol></li><li> Método de extrusión <ol><li> Tome los 10 l de suspensiones lipídicas multilamelares y añadir 150 l de tampón SLB. </li><li> Transferir la suspensión a un tubo criogénico. </li><li> Congelar la suspensión de lípidos sumergiendo el tubo criogénico durante unos segundos en nitrógeno líquido. </li><li> Descongele lasuspensión de lípidos sumergiendo el tubo criogénico en un baño de agua a temperatura ambiente o 37 ° C durante unos minutos. Repita los pasos de congelación-descongelación por lo menos 10 veces. </li><li> Con el fin de extruir la suspensión de lípidos, utilizar una membrana de policarbonato con tamaño de poro 200 nm (otros tamaños de poro están disponibles como, 100 nm o 400 nm) y un dispositivo de extrusión comercial 26. Nota: Actualmente, hay dos dispositivos de extrusión comercialmente disponible: una extrusora manual está disponible para los pequeños volúmenes (200 l a unos pocos ml). En este caso, la muestra se extruye a través de la membrana empujando manualmente la suspensión de ida y vuelta entre dos jeringas. Dependiendo del fabricante, tendrían que combinarse para alcanzar el volumen mínimo de la puesta en marcha alícuotas de lípidos. Para volúmenes más grandes se utilizan dispositivos más sofisticados (hasta 50 ml) en el que la suspensión es forzado a través de la membrana de policarbonato mediante el uso de gas comprimido. Set-up y extrusión condiciones pueden cambiar de acuerdo con el Ministerio de Defensaeléct. Consulte las instrucciones del fabricante antes de usar. Este protocolo se refiere a la extrusora manual para pequeños volúmenes. </li><li> Equilibrar la extrusora en agua haciendo pasar agua a través de la extrusora. Sumerja la membrana en agua. </li><li> Coloque la membrana entre los dos pistones, montar el dispositivo y equilibrar en tampón, haciendo pasar el tampón a través de la extrusora, de una jeringa a la otra. Este paso permite, además, pruebas de la falta de estanqueidad del sistema. Si se filtra, desmontar y volver a montar de nuevo el cambio de la membrana. </li><li> Tome la suspensión de lípidos usando una jeringa de la extrusora (&#39;lado sucio&#39;). </li><li> Conecte la jeringa que contiene la suspensión de lípidos en una de las cámaras y la jeringa vacía en la cámara opuesta. </li><li> Empuje la jeringa en un extremo. Pasar la solución a través de la membrana y en la jeringa opuesta. Este es el paso 1 st. </li><li> Pasar a través de la membrana para un total de 31 veces talesque la solución termina en la jeringuilla opuesta (&#39;lado limpio&#39;). Nota: Consulte la membrana después de la extrusión. Si se rompe, entonces el proceso de extrusión no tuvo éxito y necesita ser repetido. </li><li> Vacíe la jeringa en un pequeño tubo. Vesículas unilamelares grandes (LUV) son estables durante 1-2 días si se mantiene a 4 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Preparación de Mica y Cubreobjetos <ol><li> Wash cubreobjetos primero en agua y luego en etanol. Aire seco. </li><li> Tome los discos de mica y retire la capa exterior con cinta adhesiva. </li><li> Coloque el disco de mica en el cubreobjetos. Colas ópticas transparentes son óptimas para que se pueda comprobar las bicapas con un microscopio de fluorescencia. </li><li> Adjuntar cilindros de plástico (diámetro 2,5 cm exterior, 2 cm de diámetro interior y 0,5 cm de altura) con óptica pegamento / grasa. Asegúrese de que todo está sellado y que no hay fugas. Utilice grasa cuando se quiere volver a utilizar los cilindros, ya que pueden ser fácilmente separados de THe cubreobjetos y se lavan. Las dimensiones de los cilindros de plástico dependen del tamaño del soporte voladizo AFM y se deben ajustar en consecuencia. </li></ol></li><li> La deposición de vesículas unilamelares en soporte sólido <ol><li> Pipetear toda la solución de liposomas directamente sobre la mica. Añada más memoria intermedia SLB para llegar a un volumen de 300 l. </li><li> Añadir 0,9 l de solución de cloruro de calcio 1 M para alcanzar una concentración final de 3 mM Ca 2+. </li><li> Incubar a 37 ° C durante 2 min y luego a 65 ° C durante al menos 10 min. Siempre cubra las bicapas con tampón. El contacto con las burbujas de aire y aire lo destruirá. Durante la incubación, añadir más tampón si es necesario, especialmente si la incubación a temperaturas más altas. Nota: Las temperaturas de incubación varían de acuerdo con las mezclas de lípidos y fases requeridas. Se necesita tiempo de incubación de al menos 10 min para formar bicapas soportadas, pero podría ser más largo, dependiendo de la temperatura y la composición. </li><li> Lavarla bicapa con agua caliente (65 ° C) tampón SLB 15-20 veces para eliminar el calcio y las vesículas no fusionadas. Tenga mucho cuidado durante las etapas de lavado para mantener la bicapa bajo tampón y pipetear suavemente la solución de lavado para evitar la destrucción de la bicapa. </li><li> Bicapas frescos soportados a temperatura ambiente antes de mediciones de AFM. Esto es necesario para formar las diferentes fases de la membrana, así como minimizar la deriva térmica en el instrumento. </li></ol></li></ol> 2. Microscopía de Fuerza Atómica Medidas 11,12 <ol><li> Imaging Nota: Realice las imágenes de microscopía de fuerza atómica en el modo de contacto o el modo tapping. De imagen soportados bicapas en solución; no permita que la solución se evapore por completo ya que esto va a destruir las bicapas. Como era de estar trabajando con tampón, se deben observar las medidas de seguridad para asegurarse de que cualquier parte AFM está protegido contra derrames de líquidos. <ol><li> Seleccionar un voladizo suave (abajo se recomienda 0,2 N / m constante del resorte) y montarlo en tél AFM. La elección de la rigidez en voladizo es más crítico para la espectroscopia de fuerza (y esto se discutirá más adelante). </li><li> Montar la muestra en el escenario AFM y asegurarse de que todos los módulos de aislamiento de vibraciones están encendidos. Espere al menos 15 minutos para equilibrar y reducir la deriva térmica del sistema. Dependiendo de la AFM configuración, especificaciones de ajuste y de imagen pueden variar. Consulte el manual del fabricante. </li><li> Acérquese a la muestra con la punta del AFM hasta que el contacto. </li><li> Desde bicapas lipídicas son generalmente 4 nm de altura, utilice el Z-rango del instrumento que le dará la mayor z-resolución (por ejemplo 1,5 micras). </li><li> Seleccione una región de la imagen. Para tener una visión general de la bicapa lipídica, un 50 micras x 50 micras o 25 micras x 25 micras región será un buen punto de partida para la imagen. Si aparecen las características más pequeñas, la imagen de un bote en áreas más pequeñas (10 m x 10 m, o 2 m x 2 m). La elección de la superficie de imágenes también depende de la r de trabajoange del escáner piezoeléctrico. Por favor consulte el manual del instrumento para ello. </li><li> Como bicapas son muy frágiles, ajustar el punto de la punta del AFM conjunto durante la exploración para mantener la fuerza, como mínimo, y corregir la deriva térmica, manteniendo contacto con la muestra. En el modo de contacto, minimizar el punto de ajuste. En el modo de grabación, maximizar el punto de ajuste. </li><li> Imágenes de proceso de ajuste de cada línea de exploración de las funciones polinómicas de nivelación. Efectuar la eliminación de línea para las exploraciones que pierden contacto con la membrana utilizando el software propietario de la empresa de fabricación de AFM. </li></ol></li><li> Fuerza Espectroscopia <ol><li> Calibrar el voladizo siguiendo las instrucciones según el protocolo del fabricante. La calibración permite la conversión de la señal eléctrica de los fotodiodos a la fuerza (Figura 1B). <ol><li> Calibrar sensibilidad de la punta para medir la deflexión como el movimiento z-piezo (en unidades de longitud) en lugar de la señal eléctrica en voltios. <br /&gt; Nota: AFM detecta cambios en la deflexión del voladizo utilizando un láser reflejados en la parte posterior de la voladizo. El láser alcanza un fotodiodo que puede detectar espacialmente la posición del punto láser. Un cambio en la deflexión del voladizo como se dobla al contacto con la muestra se detecta por este fotodiodo como &quot;deflexión vertical&quot;, y esto es en las unidades de tensión. Dado que el voladizo se mueve por el piezo-z, la deflexión vertical está relacionado con el movimiento en el z-piezo. La relación entre la deflexión vertical y z-movimiento se llama sensibilidad y convierte el voltaje a distancia. </li><li> Calcular la constante de resorte en voladizo utilizando el método de frecuencia de ruido térmico, generalmente incorporado en el software AFM. En este método, representar gráficamente la amplitud de la vibración del ruido con respecto a la frecuencia de oscilación, la creación de un gráfico de densidad espectral de potencia. Esta parcela se mostrará un pico alrededor de la frecuencia de resonancia. La frecuencia donde el i amplituds la mayor es la frecuencia de resonancia. Montar una función Lorentzian alrededor del pico para calcular automáticamente la constante del resorte por el software. Algunos recursos útiles para la teoría del método ruido térmico se dan en las referencias 27-30. </li></ol></li><li> Después de la formación de imágenes un área de la bicapa, seleccione una región x 5 m 5 m en la bicapa para realizar espectroscopia de fuerza. </li><li> Configure el AFM para que tome las curvas de fuerza en una cuadrícula de esa región de 16 x 16. Esto se traduce en 256 curvas de fuerza por región. El espacio entre dos puntos vecinos debería ser suficiente para evitar que el área de la membrana se sondeó por un punto coincidiría con el siguiente punto. Esto depende de la radio de la punta. Una distancia 100 nm entre dos puntos sería ideal. Divida el 5 micras x 5 región micras en 16 x 16 cuadrícula. Dependiendo del tamaño de la fase, se puede seleccionar una región más pequeña o más grande, y luego ajustar el tamaño de la cuadrícula en consecuencia. </li><li> Ajuste de desplazamiento z-piezo a400 nm. Esto determina el rango máximo de movimiento de la z-piezo. Debe ser lo suficientemente grande para asegurarse de que el voladizo ha completamente retraída lejos de la muestra en entre mediciones. </li><li> Ajuste la velocidad de aproximación a 800 nm / seg y retraer la velocidad a 200 nm / seg. Utilice una velocidad de aproximación entre 400 a 6.000 nm / seg dependiendo de la composición bicapa y fase lipídica a ser estudiados 6,16. </li><li> Después de configurar todos los parámetros, adquirir curvas de fuerza, pulsando el botón &quot;Ejecutar&quot; del software AFM. </li><li> Guardar curvas de fuerza como la fuerza contra curvas de altura (una medida del movimiento z-piezo). Esto no toma en cuenta la flexión del voladizo cuando está en contacto con la muestra. Durante la etapa de procesamiento de datos, el software AFM permite la corrección de flexión en voladizo para obtener fuerza frente a curvas de separación punta-muestra (Figura 1C), lo que dará valores adecuados para el espesor bicapa. Los valores de corrección se incorporan normalmente en la Calibración, que se guarda con cada curva de fuerza. Calcular la separación punta-muestra restando la desviación vertical del movimiento piezo en un punto dado. Nota: El pico en la curva de fuerza enfoque (el valor de la fuerza va hacia abajo, incluso si el movimiento en voladizo está todavía en el ciclo de aproximación) es la fuerza de avance de la membrana, mientras que la diferencia entre la posición de este pico y la posición del punto donde la fuerza comienza a aumentar de nuevo proporciona el espesor de la membrana. </li><li> Adquirir al menos 500 curvas de fuerza para cada condición para obtener buenas estadísticas. Trazar un histograma de los valores utilizando programas como Origen o MatLab, y encajar los histogramas para una distribución gaussiana para obtener el pico y la anchura de la distribución. </li></ol></li></ol>

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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+validation+of+theoretical+models+for+the+frequency+response+of+atomic+force+microscope+cantilever+beams+immersed+in+fluids.">Experimental validation of theoretical models for the frequency response of atomic force microscope cantilever beams immersed in fluids.</a> Journal of Applied Physics. 87, 3973 (2000).</li><li>Sader, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frequency+response+of+cantilever+beams+immersed+in+viscous+fluids+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">Frequency response of cantilever beams immersed in viscous fluids with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 84, 64 (1998).</li><li>Sader, J. E., Pacifico, J., Green, C. P., Mulvaney, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=General+scaling+law+for+stiffness+measurement+of+small+bodies+with+applications+to+the+atomic+force+microscope.">General scaling law for stiffness measurement of small bodies with applications to the atomic force microscope.</a> Journal of Applied Physics. 97, 12490310 (2005).</li><li>Canale, C., Torre, B., Ricci, D., Braga, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognizing+and+avoiding+artifacts+in+atomic+force+microscopy+imaging.">Recognizing and avoiding artifacts in atomic force microscopy imaging.</a> Methods Mol Biol. 736, 31-43 (2011).</li><li>Lee, M. -. T., Chen, F. -. Y., Huang, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Energetics+of+Pore+Formation+Induced+by+Membrane+Active+Peptides.">Energetics of Pore Formation Induced by Membrane Active Peptides.</a> Biochemistry-US. 43, 3590-3599 (2004).</li><li>Henriksen, J. R., Ipsen, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Measurement+of+membrane+elasticity+by+micro-pipette+aspiration.">Measurement of membrane elasticity by micro-pipette aspiration.</a> The European physical journal. E, Soft matter. 14, 149-167 (2004).</li><li>Nichols-Smith, S., Teh, S. -. Y., Kuhl, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermodynamic+and+mechanical+properties+of+model+mitochondrial+membranes.">Thermodynamic and mechanical properties of model mitochondrial membranes.</a> BBA-Biomembranes. 1663, 82-88 (2004).</li><li>Tian, A., Johnson, C., Wang, W., Baumgart, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Line+Tension+at+Fluid+Membrane+Domain+Boundaries+Measured+by+Micropipette+Aspiration.">Line Tension at Fluid Membrane Domain Boundaries Measured by Micropipette Aspiration.</a> Phys. Rev. Lett. 98, (2007).</li><li>Rigaud, J. -. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Membrane+proteins:+functional+and+structural+studies+using+reconstituted+proteoliposomes+and+2-D+crystals.">Membrane proteins: functional and structural studies using reconstituted proteoliposomes and 2-D crystals.</a> Brazilian Journal of Medical and Biological Research. 35, 753-766 (2002).</li></ol>

Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.

SLBS compuestas de DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se formaron en mica después de la adsorción de vesículas y la ruptura inducida por cloruro de calcio. Esta composición lipídica separa en L d y L o fases. La fase L o se enriquece en la esfingomielina y colesterol, y es menos fluido / más viscoso (Figura 1A) que la fase L 11 d. La separación de L o de la fase L d manifiesta como estructuras circulares elevadas por encima de los...

Microscopía de Fuerza Atómica (AFM) genera una imagen de una superficie por la exploración a través de un área de la muestra utilizando un voladizo con una punta muy afilada 1. El movimiento de la voladizo sondea la topología de la superficie de la muestra. AFM ha sido ampliamente aplicado a las moléculas biológicas - incluyendo proteínas, el ADN y las membranas, debido a su versatilidad en el análisis de muestras fijadas en el aire o estado casi nativo en líquido 2-5. Aparte de su capacidad de imagen de alta resolución en el rango nanométrico, el voladizo AFM actúa como un resorte para sondear fuerzas de interacción (adhesión) y la repulsión y las propiedades mecánicas de la muestra 5,6. Esto se conoce como espectroscopia de fuerza. En este modo, la sonda se acerca primero la muestra y ejerce una fuerza sobre él, entonces se retrae hasta que se pierde el contacto con la muestra (Figura 1A). Las curvas generadas muestran la fuerza como una función de la distancia del voladizo, tanto para la aplicacióncucaracha y retracción. Varias propiedades, incluyendo el módulo elástico para medir la rigidez de un material, y fuerzas de adhesión se pueden derivar. Bicapas lipídicas soportados son membranas modelo biológicas situadas en la parte superior de un soporte sólido - generalmente mica, vidrio de borosilicato, sílice fundida, o silicio 7 oxidado. Ellos se preparan utilizando diversas técnicas como la deposición de la vesícula, el método Langmuir-Blodgett y spin-coating 8,9. Formación de imágenes AFM se ha utilizado para seguir la formación de estas bicapas soportadas 10, y la sonda diferentes estructuras formadas por membranas de diferentes composiciones 11-15. Realización de espectroscopia de fuerza en bicapas soportadas resultados en un pico en la curva de enfoque. Este pico indica la fuerza necesaria para perforar la bicapa, y se llama fuerza de avance. El espesor bicapa también se puede medir usando la curva de fuerza 6. La fuerza de avance típico de bicapasrango entre 1-50 nN 6. Estas propiedades dependen de embalaje de lípidos (fase líquida o gel) y la estructura (longitud de la cadena acilo y el grado de insaturación) y alterado por agentes 16-de membrana activa. La teoría detrás de la ruptura ha sido explicada 17 y otros parámetros experimentales tales como suavidad voladizo, radio de la punta y la velocidad de enfoque también afectará la fuerza avance 15,16,18. Espectroscopia de fuerza se ha utilizado para analizar las propiedades de las diferentes fases de lípidos 11,19, cambios en la composición dependiente de 12,20, así como efectos de otras biomoléculas, como los péptidos, sobre la estabilidad de la membrana 21. La orientación plana de bicapas soportadas es ventajoso para la combinación de AFM con otros métodos tales como resonancia de plasmón superficial 22 y microscopía de fluorescencia 11,19 para caracterizar mejor la estructura y propiedades de las membranas. Esta detallada proto vídeocol está destinado a preparar a bicapas lipídicas apoyados mediante la deposición de vesículas y analizarlos con AFM y espectroscopia de fuerza. Mientras que las vesículas de varios tamaños se pueden usar para preparar bicapas, este protocolo se centra en pequeñas y grandes vesículas unilamelares. Bicapas soportadas que fase separada en líquido ordenado (L o) y (L d) fases desordenadas líquidos se caracterizaron 11,15. La membrana se compone de di-oleoil-fosfatidilcolina (DOPC), esfingomielina (SM) y el colesterol (Chol) en 2: 2: 1. Esta composición modelos las balsas de lípidos, que se proponen a comportarse como plataformas importantes para el tráfico de proteínas y la clasificación, la señalización celular y otros procesos celulares 23,24.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphocholine</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>850375P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in sealed vials. Dissolve all powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C. For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sphingomyelin (Brain, Porcine)</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>860062P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cholesterol</td>
			<td>Avanti Polar Lipids, Inc.</td>
			<td>700000P</td>
			<td>Comes as lyophilized powder in large sealed plastic containers. Dissolve a spatula point of powder powder in chloroform upon opening. Store extra as dried lipid films, under inert atmosphere, at -20&#176;C.&#160; For more information on storage and handling visit http://www.avantilipids.com/index.php?option=com_content&#38;view=article&#38;id=1679&#38;Itemid=398</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride (NaCl), 99.8%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>9265.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium chloride (KCl), 88%</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P9541</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium hydrogenphosphate (Na2HPO4), &#62;99%</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A1046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Potassium dihydrogenphosphate (KH2PO4), 99%</td>
			<td>Carl Roth GmbH + Co. KG</td>
			<td>3904.1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calcium chloride dihydrate (CaCl2), molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A4689</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HEPES, molecular biology grade</td>
			<td>AppliChem GmbH</td>
			<td>A3724</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslip, 24x60 mm, 1mm thickness</td>
			<td>Duran Group</td>
			<td>2355036</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mica blocks</td>
			<td>NSC Mica Exports Ltd.</td>
			<td></td>
			<td>These are mica pieces at least 1 sq. Inches in area and thickness randing from 0.006 inches to 0.016 inches. They are cut to a specific size by the company for shipping. Small mica discs can be punched from the mica blocks using the punch and die set.&#160; Always handle mica with gloves or tweezers.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Punch and Die Set</td>
			<td>Precision Brand Products, Inc</td>
			<td>40105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Optical Adhesive</td>
			<td>Norland Products, Inc.</td>
			<td>NOA 88</td>
			<td>Liquid adhesive that hardens when cured under long wavelength UV light.&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Laboratory Equipment Grease</td>
			<td>Borer Chemie AG</td>
			<td>Glisseal N</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Liposome Extruder</td>
			<td>Avestin</td>
			<td>LiposoFast-Basic</td>
			<td>As an alternative one can also look at offers from Northern Lipids, Inc.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive Tape</td>
			<td>3M</td>
			<td>Scotch(R) Magic (TM) Tape 810 (1-inch)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bath Sonicator</td>
			<td>Bandelin Sonorex Digitec</td>
			<td>DT-31</td>
			<td>No heating, Frequency: 35 kHz, Ultrasonic Peak Output: 160 W, HF Power: 40 W. http://www.bandelin.com/datenblaetter/dt/DT_31_H_1798d_DE_GB_FR_BANDELIN.pdf</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicon Nitride AFM Cantilever&#160;</td>
			<td>Bruker AFM Probes</td>
			<td>DNP-10</td>
			<td>Each cantilever has four tips and their nominal tip radius is 20 nm (with possible maximum at 60 nm). Based on the specifications, we use tip D with resonance frequency of 18 kHz, and nominal spring constant of 0.06 N/m.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>AFM</td>
			<td>JPK</td>
			<td>JPK Nanowizard II mounted on Zeiss Axiovert 200</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

atomic force microscopy imaging and force spectroscopy of supported lipid bilayers

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient magnification to examine membrane substructures and even individual molecules. AFM can act as a force probe to measure interactions and mechanical properties of membranes. Supported lipid bilayers are conventionally used as membrane models in AFM studies. In this protocol, we demonstrate how to prepare supported bilayers and characterize their structure and mechanical properties using AFM. These include bilayer thickness and breakthrough force. 
The information provided by AFM imaging and force spectroscopy help define mechanical and chemical properties of membranes. These properties play an important role in cellular processes such as maintaining cell hemostasis from environmental stress, bringing membrane proteins together, and stabilizing protein complexes.

Bicapas soportadas lípidos compuestos por DOPC: SM: Chol (2: 2: 1) se obtuvieron imágenes de AFM (Figura 2 AC). Debido a la composición lipídica, se observaron SM / Chol-rica o L y DOPC-ricos fases L d. El perfil de la altura de la imagen AFM puede proporcionar información importante sobre la estructura de la membrana. Al observar el perfil de altura, el espesor de la bicapa se puede medir en presencia de defectos en la membrana (Figura 2B), o la diferencia de...

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Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Fuerza Atómica Microscopía Imaging y Fuerza Espectroscopia de admitidos Bilayers lípidos

Atomic force microscopy (AFM) is a versatile, high-resolution imaging technique that allows visualization of biological membranes. It has sufficient ...

atomic-force-microscopy-imaging-force-spectroscopy-supported-lipid

Research

JoVE Journal

Bioengineering

14.5K vistas.  Interfaculty Institute for Biochemistry. We describe a protocol for preparation of supported lipid bilayers and its characterization using atomic force microscopy and force spectroscopy.

Video: Atomic Force Microscopy Imaging and Force Spectroscopy of Supported Lipid Bilayers

Bacterial Immobilization for Imaging by Atomic Force Microscopy

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface. It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid environment, without the need to chemically treat the sample. In order to accomplish this goal, the sample must sufficiently adhere to the mounting surface to prevent removal by forces exerted by the scanning AFM cantilever tip. In many instances, successful imaging depends on immobilization of the sample to the mounting surface. Optimally, immobilization should be minimally invasive to the sample such that metabolic processes and functional attributes are not compromised. By coating freshly cleaved mica surfaces with porcine (pig) gelatin, negatively charged bacteria can be immobilized on the surface and imaged in liquid by AFM. Immobilization of bacterial cells on gelatin-coated mica is most likely due to electrostatic interaction between the negatively charged bacteria and the positively charged gelatin. Several factors can interfere with bacterial immobilization, including chemical constituents of the liquid in which the bacteria are suspended, the incubation time of the bacteria on the gelatin coated mica, surface characteristics of the bacterial strain and the medium in which the bacteria are imaged. Overall, the use of gelatin-coated mica is found to be generally applicable for imaging microbial cells.

Live Gram-negative and Gram-positive bacteria can be immobilized on gelatin-coated mica and imaged in liquid using Atomic Force Microscopy (AFM).

Inmovilización de bacterias para tratamiento de imágenes de microscopía de fuerza atómica

AFM is a high-resolution (nm scale) imaging tool that mechanically probes a surface.  It has the ability to image cells and biomolecules, in a liquid ...

Investigación

Bioingeniería

Visualization of Recombinant DNA and Protein Complexes Using Atomic Force Microscopy

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On the end of the microscope's cantilever is a nano-scale probe, which traverses image areas ranging from nanometers to micrometers, measuring the elevation of macromolecules resting on the substrate surface at any given point. Electrostatic forces cause proteins, lipids, and nucleic acids to loosely attach to the substrate in random orientations and permit imaging. The generated data resemble a topographical map, where the macromolecules resolve as three-dimensional particles of discrete sizes (Figure 1) 1,2. Tapping mode AFM involves the repeated oscillation of the cantilever, which permits imaging of relatively soft biomaterials such as DNA and proteins. One of the notable benefits of AFM over other nanoscale microscopy techniques is its relative adaptability to visualize individual proteins and macromolecular complexes in aqueous buffers, including near-physiologic buffered conditions, in real-time, and without staining or coating the sample to be imaged. 
The method presented here describes the imaging of DNA and an immunoadsorbed transcription factor (i.e. the glucocorticoid receptor, GR) in buffered solution (Figure 2). Immunoadsorbed proteins and protein complexes can be separated from the immunoadsorbing antibody-bead pellet by competition with the antibody epitope and then imaged (Figure 2A). This allows for biochemical manipulation of the biomolecules of interest prior to imaging. Once purified, DNA and proteins can be mixed and the resultant interacting complex can be imaged as well. Binding of DNA to mica requires a divalent cation 3,such as Ni2+ or Mg2+, which can be added to sample buffers yet maintain protein activity. Using a similar approach, AFM has been utilized to visualize individual enzymes, including RNA polymerase 4 and a repair enzyme 5, bound to individual DNA strands. These experiments provide significant insight into the protein-protein and DNA-protein biophysical interactions taking place at the molecular level. Imaging individual macromolecular particles with AFM can be useful for determining particle homogeneity and for identifying the physical arrangement of constituent components of the imaged particles. While the present method was developed for visualization of GR-chaperone protein complexes 1,2 and DNA strands to which the GR can bind, it can be applied broadly to imaging DNA and protein samples from a variety of sources.

A tapping mode atomic force microscope (AFM) method for the visualization of plasmid DNA, cytoplasmic proteins, and DNA-protein complexes is described. The method includes alternate approaches for preparing samples for AFM imaging following biochemical manipulation. DNA containing specific protein interacting regions are observed in near-physiologic buffer conditions.

La visualización de ADN recombinante y complejos de proteínas utilizando microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows for the visualizing of individual proteins, DNA molecules, protein-protein complexes, and DNA-protein complexes. On ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

La cuantificación de las propiedades mecánicas de la glicocálix endotelial con la Microscopía de Fuerza Atómica

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

Medición de las propiedades mecánicas de las células vivas mediante microscopía de fuerza atómica

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

Preparation of Mica Supported Lipid Bilayers for High Resolution Optical Microscopy Imaging

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction with other compounds, such as drugs or peptides. However SLB characteristics differ depending on the support used. 
Commonly used techniques for SLB imaging and measurements are single molecule fluorescence microscopy, FCS and atomic force microscopy (AFM). Because most optical imaging studies are carried out on a glass support, while AFM requires an extremely flat surface (generally mica), results from these techniques cannot be compared directly, since the charge and smoothness properties of these materials strongly influence diffusion. Unfortunately, the high level of manual dexterity required for the cutting and gluing thin slices of mica to the glass slide presents a hurdle to routine use of mica for SLB preparation. Although this would be the method of choice, such prepared mica surfaces often end up being uneven (wavy) and difficult to image, especially with small working distance, high numerical aperture lenses. Here we present a simple and reproducible method for preparing thin, flat mica surfaces for lipid vesicle deposition and SLB preparation. Additionally, our custom made chamber requires only very small volumes of vesicles for SLB formation. The overall procedure results in the efficient, simple and inexpensive production of high quality lipid bilayer surfaces that are directly comparable to those used in AFM studies.

We present a method of preparing mica supported lipid bilayers for high resolution microscopy. Mica is transparent and flat on an atomic scale, but rarely used in imaging because of handling difficulties; our preparation results in even deposition of the mica sheet, and reduces the material used in bilayer preparation.

Preparación de Mica Soportado bicapa lipídica de Alta Resolución Microscopía Óptica de Imagen

Supported lipid bilayers (SLBs) are widely used as a model for studying membrane properties (phase separation, clustering, dynamics) and its interaction ...

Novel Atomic Force Microscopy Based Biopanning for Isolation of Morphology Specific Reagents against TDP-43 Variants in Amyotrophic Lateral Sclerosis

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in Parkinson&#8217;s disease and beta-amyloid and tau in Alzheimer&#8217;s disease, it is critically important to develop morphology specific reagents that can selectively target these disease-specific protein variants to study the role of these variants in disease pathology and for potential diagnostic and therapeutic applications. We have developed novel atomic force microscopy (AFM) based biopanning techniques that enable isolation of reagents that selectively recognize disease-specific protein variants. There are two key phases involved in the process, the negative and positive panning phases. During the negative panning phase, phages that are reactive to off-target antigens are eliminated through multiple rounds of subtractive panning utilizing a series of carefully selected off-target antigens. A key feature in the negative panning phase is utilizing AFM imaging to monitor the process and confirm that all undesired phage particles are removed. For the positive panning phase, the target antigen of interest is fixed on a mica surface and bound phages are eluted and screened to identify phages that selectively bind the target antigen. The target protein variant does not need to be purified providing the appropriate negative panning controls have been used. Even target protein variants that are only present at very low concentrations in complex biological material can be utilized in the positive panning step. Through application of this technology, we acquired antibodies to protein variants of TDP-43 that are selectively found in human ALS brain tissue. We expect that this protocol should be applicable to generating reagents that selectively bind protein variants present in a wide variety of different biological processes and diseases.

Using atomic force microscopy in combination with biopanning technology we created a negative and positive biopanning system to acquire antibodies against disease-specific protein variants present in any biological material, even at low concentrations. We were successful in obtaining antibodies to TDP-43 protein variants involved in Amyotrophic Lateral Sclerosis.

Novela Microscopía de Fuerza Atómica Based biopanning para el aislamiento de Morfología reactivos específicos contra la TDP-43 variantes en la esclerosis lateral amiotrófica

Because protein variants play critical roles in many diseases including TDP-43 in Amyotrophic Lateral Sclerosis (ALS), alpha-synuclein in ...

Single Molecule Fluorescence Microscopy on Planar Supported Bilayers

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background in optics and laser physics to a discipline that is now enjoying vivid attention by life-scientists of all venues 1. This is because single molecule imaging has the unique potential to reveal protein behavior in situ in living cells and uncover cellular organization with unprecedented resolution below the diffraction limit of visible light 2. Glass-supported planar lipid bilayers (SLBs) are a powerful tool to bring cells otherwise growing in suspension in close enough proximity to the glass slide so that they can be readily imaged in noise-reduced Total Internal Reflection illumination mode 3,4. They are very useful to study the protein dynamics in plasma membrane-associated events as diverse as cell-cell contact formation, endocytosis, exocytosis and immune recognition. Simple procedures are presented how to generate highly mobile protein-functionalized SLBs in a reproducible manner, how to determine protein mobility within and how to measure protein densities with the use of single molecule detection. It is shown how to construct a cost-efficient single molecule microscopy system with TIRF illumination capabilities and how to operate it in the experiment.

Preparation of protein-functionalized planar glass-supported lipid bilayers, determination of protein mobility within and measurement of protein densities is shown here. A roadmap to building a noise-reduced Total Internal Reflection microscope is outlined, which allows visualizing single bilayer-resident fluorochromes with high spatiotemporal resolution.

Bilayers Individual Molécula microscopía de fluorescencia en planar compatibles

In the course of a single decade single molecule microscopy has changed from being a secluded domain shared merely by physicists with a strong background ...

Fabrication and Implementation of a Reference-Free Traction Force Microscopy Platform

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their microenvironment. While many approaches exist for measuring cell-induced material strain, here we provide a methodology for monitoring strain with sub-micron resolution in a reference-free manner. Using a two-photon activated photolithographic patterning process, we demonstrate how to generate mechanically and bio-actively tunable synthetic substrates containing embedded arrays of fluorescent fiducial markers to easily measure three-dimensional (3D) material deformation profiles in response to surface tractions. Using these substrates, cell tension profiles can be mapped using a single 3D image stack of a cell of interest. Our goal with this methodology is to make traction force microscopy a more accessible and easier to implement tool for researchers studying cellular mechanotransduction processes, especially newcomers to the field.

This protocol provides instructions for implementing multiphoton lithography to fabricate three-dimensional arrays of fluorescent fiducial markers embedded in poly(ethylene glycol)-based hydrogels for use as reference-free, traction force microscopy platforms. Using these instructions, measurement of 3D material strain and calculation of cellular tractions is simplified to promote high-throughput traction force measurements.

Fabricación e implementación de una plataforma de microscopía de fuerza de tracción sin referencia

Quantifying cell-induced material deformation provides useful information concerning how cells sense and respond to the physical properties of their ...

Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in elasticity can propagate or trigger the onset of major diseases like cancer or osteoarthritis (OA). Atomic force microscopy (AFM) has emerged as a strong tool to qualitatively and quantitatively characterize the biomechanical properties of specific biological target structures on a microscopic scale, measuring forces in a range from as small as the piconewton to the micronewton. Biomechanical properties are of special importance in musculoskeletal tissues, which are subjected to high levels of strain. OA as a degenerative disease of the cartilage results in the disruption of the pericellular matrix (PCM) and the spatial rearrangement of the chondrocytes embedded in their extracellular matrix (ECM). Disruption in PCM and ECM has been associated with changes in the biomechanical properties of cartilage. In the present study we used AFM to quantify these changes in relation to the specific spatial pattern changes of the chondrocytes. With each pattern change, significant changes in elasticity were observed for both the PCM and ECM. Measuring the local elasticity thus allows for drawing direct conclusions about the degree of local tissue degeneration in OA.

We present a method to investigate early osteoarthritic changes at the cellular level in articular cartilage by using atomic force microscopy (AFM).

Aplicación de microscopía de fuerza atómica para detectar la osteoartritis temprana

Biomechanical properties of cells and tissues not only regulate their shape and function but are also crucial for maintaining their vitality. Changes in ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

Automatización De Las Mediciones De Microscopio De Fuerza Bio-Atómica En Cientos De Células De C. albicans

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...