Este método puede ayudar a responder preguntas clave en el estudio de las interacciones huésped-patógeno al permitir el examen de la codificación, la no codificación y la expresión de ARN viral implicada en la respuesta de aminoácidos del huésped, así como cómo un patógeno puede afectar las funciones biológicas del huésped. La principal ventaja de esta técnica es que presenta un protocolo optimizado para el procesamiento de ARNm y ARN no codificantes de bibliotecas RNAseq reducidas por globina a partir de una sola muestra de sangre entera. Demostrando la técnica estará Sarah Anderson, una técnico de mi laboratorio.
Comience por centrifugar los tubos sanguíneos a 50 20 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente. Trabajando en un armario de seguridad biológica, después de retirar el sobrenadante, añadir ocho mililitros de agua libre de RNase al pellet. Cierre los tubos y vórtice el pellet hasta que se disuelva visiblemente, luego centrifuga los tubos a 50 20 veces G durante 10 minutos a temperatura ambiente para recuperar el pellet.
Trabajando en un armario de seguridad biológica, deseche el sobrenadante y guarde el pellet. Para aislar el ARN total, comience por pipetear 300 microlitros de tampón de unión de lisis al pellet. Después del vórtice, transfiera la mezcla de cada tubo a un nuevo tubo centrífugo de 1,5 mililitros.
Añadir 30 microlitros de aditivo homogeneado del kit de aislamiento miRNA. Vórtice los tubos y colóquelos en el hielo durante 10 minutos. Trabajando en una campana de humo, retire los tubos del hielo y agregue 300 microlitros del reactivo de cloroformo de fenol ácido del kit y el vórtice de nuevo para mezclar.
Después de centrifugar a 10.000 veces G durante cinco minutos a temperatura ambiente, retire cuidadosamente la fase acuosa a un tubo nuevo. Sobre la base de la cantidad de recuperación acuosa del paso anterior, añadir 1,25 veces el volumen de 100%etanol al fago acuoso en cada tubo y pipeta para mezclar. Prepare tubos de recogida nuevos que contengan un cartucho de filtro para cada muestra.
Pipeta aproximadamente 675 microlitros de la mezcla de izado y etanol en el cartucho del filtro. Centrifugar brevemente a 10.000 veces G para pasar líquido a través del filtro. Deseche el flujo a través.
Repita la mezcla de izado-etanol añadiendo al filtro y centrifugación hasta que se haya utilizado por completo. Agregue 700 microlitros de solución de lavado uno del kit al cartucho del filtro. Centrifugar brevemente para tirar de la solución a través de los filtros.
Deseche el flujo y mantenga los mismos cartuchos de filtro y tubos de recogida. Agregue 500 microlitros de solución de lavado dos-tres a cada cartucho de filtro. Después de centrifugar de nuevo, deseche el flujo y repita el paso de lavado.
Para eliminar cualquier líquido residual de los cartuchos de filtro, gírelos 60 segundos adicionales. Transfiera los cartuchos a tubos de recogida frescos. Agregue 100 microlitros de agua sin nucleasa precalentada de 95 grados Celsius al centro de cada cartucho de filtro.
Centrifugar los cartuchos durante aproximadamente 20 a 30 segundos en la centrífuga de sobremesa a la velocidad máxima. Para preformar la hibridación con oligos de reducción de globina, primero desnaturalizar el ARN añadiendo cada muestra extraída en un tubo de reacción sin nucleasa de 0,2 mililitros de paredes delgadas. Coloque los tubos en un ciclor térmico a 70 grados Centígrados durante dos minutos.
Después de eso, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo para obtener una calidad óptima de ARN. Mientras los tubos se enfrían, prepare 400 microlitros de mezcla de oligo de reducción de globina 10X y tampón de hibridación de oligo 10X en un tubo de dos mililitros. Para hacer la mezcla de hibridación, agregue seis microgramos de muestra de ARN, dos microlitros de la mezcla de oligo de reducción de 10X de globina, un microlitro de tampón de hibridación de oligonú 10X y nuclese agua libre a un volumen final de 10 microlitros a cada tubo de reacción de paredes delgadas de 0,2 mililitros, sin nucleasas.
Coloque los tubos en el ciclor térmico a 70 grados centígrados durante dos minutos. Después de eso, coloque inmediatamente los tubos sobre hielo. Para realizar la digestión RNase H, primero diluya 10X RNase H a un X RNase H con un búfer X RNase H.
Prepare la mezcla de reacción RNase H combinando dos microlitros de tampón 10X RNase, un microlitro de inhibidor de la ARNa y dos microlitros de un X RNase H, y cinco microlitros de agua libre de nucleasas a un volumen total de 10 microlitros. Agregue 10 microlitros de la mezcla de reacción RNase H a las muestras de hibridación de reducción de globina y mezcle bien. Digerir esta reacción a 37 grados celsius durante 10 minutos y luego enfriar a cuatro grados Celsius.
Detenga la digestión añadiendo un microlitro de EDTA molar a la sonda y transfiera todo el contenido del tubo a un tubo fresco de 1,5 mililitros. Inmediatamente después de eso, añadir 80 microlitros de agua libre de RNase, 350 microlitros de tampón de lelisis, luego 250 microlitros de 100% etanol a cada tubo y mezclar bien por pipeteo. Transfiera cada muestra de 700 microlitros a un cartucho de filtro de elución separado colocado en un tubo de recolección de dos mililitros para recoger el flujo a través.
Centrifugar durante 15 segundos a 8.000 veces G o superior y luego deseche el flujo a través. Coloque los mismos cartuchos de filtro de elución en nuevos tubos de recogida de dos mililitros. Para lavar las membranas del cartucho de filtro, agregue 500 microlitros del tampón de lavado suave a los cartuchos de filtro y centrífuga durante 15 segundos a 8.000 veces G o más.
Deseche el flujo a través. A continuación, utilizando los mismos tubos de recogida, agregue 500 microlitros de 80% de etanol a los cartuchos de filtro. Centrifugar durante dos minutos a 8.000 veces G y más.
Deseche los tubos de flujo y de recogida y guarde las columnas de giro de elución. Coloque cada columna de giro de elución en un nuevo tubo de recolección de dos mililitros. Centrifugar a toda velocidad durante cinco minutos con la tapa abierta en los cartuchos de filtro para secar las membranas de la columna de centrifugado y evitar el arrastre de etanol.
Después de desechar los tubos de recogida, coloque cada cartucho de filtro seco en un tubo de recogida fresco de 1,5 mililitros. Agregue 14 microlitros de agua libre de RNase directamente al centro de la membrana del cartucho del filtro. Para eluir el ARN, centrifugar los tubos durante 60 segundos a toda velocidad y luego continuar con la evaluación y preparación de ARN.
La muestra agotada por globina ahora se puede dividir y utilizar para preparar las pequeñas bibliotecas de ARN no codificantes, así como el ARNm agotado en ribo y las bibliotecas de ARN largas y no codificantes. Después de preparar las bibliotecas de expresiones de las muestras de sangre entera agotadas por globinas y agotadas por ribo utilizando este protocolo, el resumen de la ejecución del archivo de electroforesis mostró una muestra de biblioteca agotada por globina con números de integridad de ARN que oscilaban entre 6.3 y 9.2. Esto resultó ser una mejora en comparación con otros estudios que utilizaron métodos de agotamiento de la globina y sólo fueron capaces de lograr números rin en o cerca de seis.
La reducción previa a laglobina y la reducción posterior a la globina de una sola muestra de sangre entera porcina mostraron que las relaciones de concentración de 260 a 280 nanómetros están en o por encima de dos. Mediante este protocolo, se obtuvieron electroferogramas basados en chip de muestras de la biblioteca de ARNm de sangre entera agotadas por globina y ribo antes de la agrupación y la secuenciación. Para las bibliotecas de ARNm, el electroferograma representativo tiene un pico de aproximadamente 280 pares base.
Para los pequeños ncRNAs, los electroferogramas representativos basados en chip contienen una gama de picos de aproximadamente 100 a 400 pares base. Los picos en aproximadamente 143 pares base corresponden a miRNAs, y los picos en aproximadamente 153 pares base corresponden a piRNAs. Al intentar este procedimiento, es importante recordar los tubos de hielo inmediatamente donde se indica.
Siguiendo este procedimiento, se deben realizar otros métodos como la secuenciación de próxima generación para responder a preguntas adicionales como la expresión diferencial, los cambios epigenéticos y su efecto en las vías y procesos biológicos. No olvide que trabajar con reactivo de fenol-cloroformo es extremadamente peligroso y se deben tomar precauciones como trabajar en una campana de humo. Además, al manipular sangre entera u organismos infecciosos, se debe trabajar en un gabinete de seguridad biológica antes de la activación del organismo infeccioso.
