La bioimpresión 3D de astrocitos supone un avance en la ingeniería de tejidos neuro, permitiendo la biofabricación de modelos in vitro que son útiles para comprender los mecanismos implicados en la enfermedad neurológica. La principal ventaja de la bioimpresión 3D es biofabricar estructuras adjuntas de células que imitan las características bioquímicas y mecánicas de los tejidos, proporcionando una mejor comprensión de la dinámica celular en la salud y la enfermedad. Este protocolo se puede aplicar a la biofabricación de otros tejidos blandos, ya que se basa en la bioimpresión 3D de una biotinta compuesta por polímeros naturales y componentes de matriz extracelular.
Para empezar, corte el tejido cortical aislado del ratón eutanasiado en trozos pequeños con una micro tijera curva. Lave las piezas de tejido tres veces con un mililitro de HBSS mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo. Después de eliminar el HBSS agregado por tercera vez, agregue un mililitro de tripsina al 0.05% e incube el tejido durante cinco minutos a 37 grados centígrados.
Para la disociación mecánica del tejido, pipetee suavemente la mezcla de tripsina tisular hacia arriba y hacia abajo 15 veces. A continuación, transfiera la mezcla disociada a un tubo cónico de 15 mililitros y agregue un volumen igual de FBS para neutralizar la actividad de tripsina. Filtre la suspensión a través de un filtro colador de células de 0,4 micrómetros para eliminar fragmentos no disociados.
Lavar el filtro con un mililitro de astrocitos de medio. Pellet por la suspensión de la celda filtrada por centrifugación. Después de desechar el sobrenadante, suspenda la bolita celular en un mililitro de medio de cultivo de astrocitos.
Transfiera la suspensión celular a un matraz de cultivo T25. Componen el volumen medio total de 3,5 mililitros e incuban las células a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Para obtener el fibrinógeno a la concentración final de tres miligramos por mililitro, transfiera 0,9 mililitros de 10 miligramos por mililitro de solución de fibrinógeno a la solución de metacriloilo de gelatina-gelatina.
Para obtener el fotoiniciador a la concentración final de 0.5% en peso por volumen, agregue 0.015 gramos de fotoiniciador a la solución preparada de gelatina-gelatina metacriloil fibrinógeno. Después del vórtice, mantenga la solución a 40 grados centígrados, protegida de la luz para evitar la degradación de PI. A continuación, filtre la solución a través de un filtro de 0,2 micrómetros en un tubo cónico estéril de 15 mililitros.
Transfiera 980 microlitros de la solución de biomaterial a un tubo cónico de 15 mililitros. Para obtener la laminina a la concentración final de dos microgramos por mililitro, agregue 20 microlitros de laminina diluida al tubo que contiene biotinta. Mezclar suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo, evitando burbujas y mantener la solución de biotinta a 37 grados centígrados hasta que esté lista para mezclarse con las células.
Tripsinizar los astrocitos primarios con tripsina al 0,05% durante 5 minutos y neutralizar la actividad de tripsina con FPS en una proporción de uno a uno. Luego, transfiera las células a un tubo cónico de 15 mililitros y centrífuga a 200 veces G durante cinco minutos. Después de contar las células, transfiera 1 veces 10 a las 6 células a un tubo cónico y centrífuga diferentes como se ha demostrado.
Deje solo 200 microlitros del sobrenadante en el tubo y suspenda la bolita celular golpeando suavemente la parte inferior del tubo cónico. Para obtener una concentración final de 1 veces 10 a las 6 células por mililitro, transfiera un mililitro de solución de gelatina-gelatina metacriloil fibrinógeno al tubo que contiene las células y homogeneice canalizando suavemente hacia arriba y hacia abajo. Use una pipeta de 1000 microlitros para transferir lentamente los astrocitos colocados en la solución de biotinta de gelatina-gelatina metacriloil fibrinógeno a una jeringa de plástico de cinco mililitros, evitando la formación de burbujas.
Conecte una aguja roma estéril de calibre 22 a la jeringa. Exponga la bioimpresora a la luz UV durante 15 minutos y luego limpie la bioimpresora con etanol al 70%, luego conecte la jeringa al cabezal de impresión de la bioimpresora y enjuague manualmente la biotinta para eliminar las burbujas restantes. Para realizar la bioimpresión, coloque a 35 milímetros el plato de cultivo en la mesa de la bioimpresora, coloque la aguja a 0,1 milímetros de distancia de la superficie del plato de cultivo para permitir el movimiento de la aguja y presione el botón Imprimir.
Una vez finalada la bioimpresión, asegúrese de que la jeringa se aleje del plato y cierre el plato de cultivo. Coloque el plato de cultivo bajo luz UV para la reticulación de gelatina metacriloil. Use una espátula estéril para transferir la construcción bioimpresa a una placa de 24 pozos.
Agregue 500 microlitros de solución de cloruro de calcio de trombina y deje actuar durante 30 minutos para permitir la reticulación de fibrina. Después de retirar la solución de reticulación, lave la construcción con dos mililitros de PBS, luego reemplace el PBS con un mililitro de medio de cultivo de astrocitos. Incubar a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono y cambiar el medio cada tres días.
Use una espátula para transferir la construcción bioimpresa a un plato de cultivo de 35 milímetros. Lave la construcción con un mililitro de PBS. Deposite 100 microlitros del reactivo muerto vivo sobre la construcción y manténgalo a 37 grados centígrados durante 30 minutos, manteniéndolo protegido de la luz.
Después de retirar el reactivo muerto vivo, lave la construcción con PBS como se ha demostrado. Transfiera la muestra a un plato confocal y observe las células dentro de la construcción bajo un microscopio confocal utilizando excitación de 488 y 570 nanómetros para la adquisición de imágenes. Después de la bioimpresión 3D, se estimó la integridad del andamio bioimpreso y se observó la formación de una estructura bien definida con células atrapadas dentro del biomaterial.
Después de los procesos de bioimpresión y reticulación, la mayoría de las células presentaron una morfología redonda cuando el constructo se incubó con un medio de astrocitos. Los andamios bioimpresos mantuvieron la integridad después de siete días de incubación, y aunque se observaron algunas células redondas, muchos astrocitos se extendieron por todo el constructo, presentando morfología astrocítica e interconexión. La viabilidad celular se evaluó inmediatamente después de la bioimpresión y los resultados mostraron que a menor velocidad, las células viables representaban hasta el 74% del total de células, siendo significativamente más altas que las células bioimpresas a mayor velocidad.
La viabilidad de los astrocitos bioimpresos se normalizó a astrocitos cultivados en 2D y los resultados indicaron que en el séptimo día, los astrocitos bioimpresos habían aumentado significativamente la viabilidad. Inmediatamente después de la bioimpresión, los astrocitos mostraron morfología redonda y ensayo de muertos vivos. Después de una semana, los astrocitos se extendieron por todo el constructo y presentaron una morfología distinta de las células, idéntica al cultivo 2D.
Los astrocitos bioimpresos en 3D se caracterizaron por la inmunofluorescencia. Después de siete días de incubación en el constructo bioimpreso, se observaron astrocitos altamente densos con una morfología similar a una estrella. Las células de astrocitos bioimpresas expresaron el marcador específico de astrocitos la proteína ácida fibrilar glial indica la retención del fenotipo astrocítico después de siete días de bioimpresión, y estos resultados indican que la composición de biotinta proporcionó un microambiente biocompatible para promover la adhesión, propagación y crecimiento de los astrocitos.
La evaluación de genes específicos y la expresión de marcadores celulares por los astrocitos bioimpresos proporcionaría evidencia de la función neuro-tisular, como la reactividad astrocitary siguiendo estímulos específicos. Este protocolo allana el camino para la biofabricación de estructuras neuro-similares más complejas compuestas por diferentes tipos de células en biomoléculas, permitiendo la imitación de nichos neurogénicos específicos.
