Los autores desean dar las gracias a Jan Hansmann (Fraunhofer IGB, Stuttgart) por su apoyo técnico para desarrollar biorreactores y la incubadora biorreactor.

1. Descelularización de la BioVaSc <ol><li> Enjuague el sistema vascular del segmento yeyunal porcina a través de un acceso arterial canulado y la luz intestinal con PBS -. Repita hasta que esté completamente limpio. </li><li> Preparar un tanque de vidrio 200 mm de diámetro con 4 adaptadores y conectarlos a través de tubos de silicona a la bomba peristáltica (Ismatec). La presión de la unidad de control se puede controlar a través de un sensor de presión que está conectado a una cúpula estéril desechable (véase la Figura 1). </li><li> Llenar las botellas de yacimientos con descelularización (DZ) solución y comprobar el sistema de tubos de posibles burbujas de aire. </li><li> Conecte la luz intestinal con las ataduras de cables a los conectores de vidrio para el flujo luminal. La bomba de solución 500 ml DZ en el acceso arterial rojo (Figura 1B) del sistema vascular. Interrumpir el proceso de bombeo cada 15 minutos, poco a presionar manualmente la totalidad de la luz intestinal. </li><li> Durante el decellularizatien el proceso, la presión de la solución tampón debe estar entre 80 a 100 mm de Hg, el modelo de la presión natural de la sangre. </li><li> Lave el BioVaSc con PBS - hasta que quede libre de restos de células (&quot;completamente blanco&quot;). </li><li> Llene el BioVaSc completamente con solución DZ e incubar se sumerge en una solución de DZ durante la noche a 4 ° C en la mecedora coctelera. </li><li> Repita el paso 1.6. </li><li> Coloque el BioVaSc en solución de DNasa y se incuba durante la noche a 4 ° C en la mecedora coctelera. </li><li> Retire la solución de DNasa y enjuague con tampón de lavado. </li><li> γ-esterilización con 25 kGy </li></ol> 2. Los diferentes tipos de células 2.1 Aislamiento de células primarias humanas dérmica microvasculares endoteliales (MVECs) y fibroblastos <ol><li> Cortar la biopsia de piel (preferentemente preputium) en tiras de 2-3 mm de ancho, con bisturí y enjuagarlos 3x con PBS - solución. </li><li> Cubra el tejido con una solución de dispasa y se incuba durante 16 - 18 horas a 4 ° C. </li><li> Epidermis Separe dermis con 2 pinzas y transferir tanto por separado en placas de Petri llenas de PBS +. </li><li> Dermis Enjuague tiras 1x con Versene. </li><li> Añadir 10 ml de solución de tripsina / EDTA a las tiras de la dermis e incubar en la incubadora durante 40 min. </li><li> Detenga la reacción enzimática inmediatamente con 1% FCS. </li><li> Traslado tiras de la piel a una placa de Petri llena de VascuLife y arañar cada tira con el bisturí 8x cada lado, añadiendo un poco de presión. </li><li> Transferir la suspensión celular producido a través de un filtro de células a un tubo de centrífuga y enjuague 3x colador celular con VascuLife. </li><li> Centrifugar el tubo a 1200 xg durante 5 min y resuspender el sedimento celular con VascuLife. </li><li> Para aislar los fibroblastos, dermis chop tiras en pedacitos utilizando el bisturí. </li><li> Añadir 10 ml de solución de colagenasa para la dermis piezas. </li><li> Incubar durante 45 min en la incubadora, centrifugar y retire con cuidado dosobrenadante. </li><li> Lavar 1x pellets con DMEM + 10% de FCS +% PenStrep, se centrífuga y se retire con cuidado el sobrenadante. </li><li> Resuspender el precipitado en el medio de cultivo y transferirla a un matraz de cultivo T75 para permitir que las células crezcan fuera del tejido. </li></ol> Línea 2.2 Tumor de células S462 La línea de células tumorales S462 (amablemente proporcionado por el Dr. Nikola Holtkamp, ​​Universidad Charité de Medicina de Berlín) se generó a partir de una vaina nerviosa periférica del tumor maligno de un paciente con el síndrome hereditario de predisposición tumoral neurofibromatosis tipo 1 9. S462 se cultivan en DMEM suplementado con 10% de FCS. Medium tiene que ser cambiado cada 2-3 días. Una vez a la semana las células tienen que ser dividido. 3. Tumor del sistema de prueba: Static Condiciones de cultivo En comparación con cultura dinámica En los sistemas de biorreactores <ol><li> Cortar el tubular SIS-Muc abrir por un lado y fijarlo entre dos anillos de metal (coronas de células, 10 mm de diámetro, la auto constructed). Cubra el SIS-Muc en medio de cultivo celular durante la noche. </li><li> Se siembran las células aisladas en el número de células definidas (ver a continuación) en uno o ambos lados de la SIS (mono-o co-cultivo de configuración). <ol><li> Semilla de 8000 células / cm 2 de MVECs primarios en un volumen total de 100 l sobre la superficie basolateral de la SIS (ex serosa). 3 horas más tarde llenar el pozo con medio para garantizar una cultura sumergida. </li><li> Permiten a las células endoteliales que se adhieran durante 3 días. Da la vuelta al sistema de cultivo estático en 180 ° y la transfiere a una placa de 12 pocillos. </li><li> Seed una mezcla de fibroblastos dérmicos primarios (8000 células / cm 2) y células tumorales (15.000 células / cm 2) dentro de un volumen total de 500 l en la superficie apical de la SIS (el lado de los antiguos lumen). </li><li> Permitir que las células se adhieran durante 3 horas y llenan el bien con medio (de cultivo sumergido, medio: 50% Vasculife + 50% de DMEM suplementado con 10% de FCS). </li><li> El sistema de prueba de tumor se cultivan en condiciones estáticas unat 37 ° C, 5% de CO 2 en la incubadora durante 14 días adicionales. Cambie el medio de cultivo cada 2-3 días. </li></ol></li><li> Para la cultura dinámica, fijar el SIS-Muc entre dos anillos de metal y semillas MVECs primarias como se describe en 3.2.1. Después de 3 días eliminar el SIS-Muc de los anillos de metal e insertar la membrana en el reactor de flujo (véanse las figuras 2C y 2D). Aplicar el fibroblastos dérmicos y células de tumor primario con una jeringa y la cánula sobre la matriz en el biorreactor, y permiten que las células se adhieran durante 3 horas antes de llenar el sistema de biorreactor con medio de cultivo. </li><li> En las siguientes condiciones de cultivo dinámicas días con flujo constante de medio (3,8 ml / min, 37 ° C, y 5% de CO 2) puede ser iniciado. La cultura dinámica se mantiene durante 14 días, se cambió el medio de cultivo después de 7 días. </li><li> La configuración de la prueba dinámica se cultiva en un incubador de auto-construido que proporciona un flujo de los medios de comunicación a través de una bomba y la temperatura necesaria y CO 2 </sub&gt; Contenido. </li></ol> 4. Métodos de caracterización para el Análisis 4.1 Fijación y de inclusión en parafina de la matriz de colágeno sembrada <ol><li> Para (inmuno-) caracterizaciones histológicas eliminar el medio de cultivo y fijar el tejido con paraformaldehído al 4% durante 2 horas. </li><li> Eliminar 4% de paraformaldehído y transferir el SIS de la pieza de metal a un casete de tejido incrustación. Riegue el tejido para retirar los restos de fijador y se deshidratan para la infiltración de parafina. </li><li> Antes de ser colocado en un bloque de parafina, corte el SIS en 2 - 3 rebanadas y colocarlas en un molde de metal base de parafina-rellenada de forma que las superficies cortadas se enfrentan a la baja. Añadir el casete de tejido en la parte superior del molde como un respaldo. </li><li> Cortar 5 micras rodajas y floten en un baño de agua a 40 ° C para enderezar, a continuación, montar las diapositivas en portaobjetos de vidrio adecuados. Diapositivas no recubiertos se utilizan para H &amp; E manchas, polylysine revestida de diapositivas para la tinción inmunohistoquímico para mejorar el apego.Deje que las rebanadas se sequen completamente. </li><li> Derrita la parafina, retírelo con xileno y se rehidratan rebanadas para después de la tinción. </li></ol> 4.2 La tinción <ol><li> Las rebanadas rehidratadas se pueden teñir con hematoxilina / eosina como tinción visión estandarizada. </li><li> Para la tinción immunhistological, fijo y cortes de tejido en parafina infiltrado deben someterse a una recuperación de antígenos para que los anticuerpos que reconocen y se unen a sus epítopos específicos. Por lo tanto, desparafinados y rehidratados diapositivas se colocan en una olla de vapor con tampón de citrato climatizada (pH 6,0) durante 20 min. </li><li> Diapositivas de transferencia a tampón de lavado (0,5 M tampón de TBS + 0,5% de Tween) y rodajas de círculo con un lápiz PAP para minimizar el volumen requerido para soluciones de tinción. </li><li> Colocar el portaobjetos en una cámara de humedad. Para asegurar una peroxidasa de rábano picante-mediada por la visualización específica de antígeno-anticuerpo de unión, la peroxidasa endógena debe estar saturada con peróxido de hidrógeno al 3%. </li><li> Antib Primariadiluciones ody se aplican a las rebanadas, se incubaron durante 1 hora a TA y se lavó cuidadosamente con tampón de lavado. </li><li> Para la detección de las consolidaciones de antígeno-anticuerpo específicos del Ultra Vision Quanto sistema de detección de HRP DAB (Thermo Scientific) se utiliza de acuerdo con el protocolo recomendado. </li><li> Los núcleos se contratiñeron con hematoxilina durante 1 min. </li><li> Los portaobjetos se montaron con un medio acuoso, se secaron, y utilizando imágenes de un microscopio inverso. </li></ol>

<ol>
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I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+vascularized+matrix+for+bladder+tissue+engineering:+matrix+preparation,+reseeding+technique+and+short-term+implantation+in+a+porcine+model.">Biological vascularized matrix for bladder tissue engineering: matrix preparation, reseeding technique and short-term implantation in a porcine model.</a> J. Urol. 173, 276-280 (2005).</li></ol>

Los autores tienen nada que revelar.

<html> Cuando la comparación de sistemas de cultivo 2D y 3D en la investigación del tumor, los sistemas de 3D, a pesar de ser el enfoque más caro, han demostrado para imitar las condiciones en microambientes biológicos mejor. Se pudo demostrar que algunas células tumorales crecen mucho más lento en un cultivo 3D que en 2D una cultura común 12, que es de acuerdo a la situación en un tumor real. Bissell y colaboradores demostraron en su trabajo que el comportamiento de las células cancerígenas de mama refleja la situación in vivo, incluyendo la morfología celular y la señalización, con mayor precisión cuando una cultura 3D dentro de una matriz ofrece las interacciones célula-ECM. Además, hicieron hincapié en la importancia del medio ambiente extracelular en 3D mediante la demostración de que los cambios en las interacciones ambientales llevaron a la reversión de las células malignas a un fenotipo normal. Además, y más importante aún, estos resultados también podrían ser confirmados en modelos animales in vivo 10,11. ontenido &quot;&gt; La comparación directa de los experimentos in vivo en animales y en modelos in vitro de tejidos revela las ventajas y desventajas de ambos sistemas. Una de las ventajas de los modelos in vitro es el permiso de un tiempo real, mucho mejor o imágenes fijas mediante microscopía. Una limitación es que que imitan las condiciones estáticas o de corto plazo, mientras que los sistemas in vivo con frecuencia progresan. La actual falta de vascularización y el transporte normal de las moléculas pequeñas, sede de la respuesta inmune, y otras interacciones célula-célula son otras desventajas de los modelos in vitro 12. Por lo tanto, en 3D sistemas in vitro como se presenta en este estudio ofrecen una adición prometedora a los experimentos con animales. Proporcionan una mejor comparabilidad con el organismo humano y por lo tanto minimizar las malas interpretaciones experimentales. Biomimetic en sistemas de modelos in vivo será por tanto ser más relevante para estudiar la forma depende de cáncer y metástasis en condiciones microambientales que regulan tumorigenesis 11. Nuestro estudio muestra que el entorno en 3D proporcionado por el SIS-Muc conduce a una formación más similar a un tumor de tejido de células, que no se observa en el cultivo de células 2D común (véase la Figura 3A). Por otra parte, el uso de células primarios derivados de biopsias de tumores es un paso muy importante hacia la medicina personalizada, una disciplina que tiene como objetivo identificar el mejor tratamiento en función de las necesidades individuales del paciente. La incorporación de las células tumorales específicos para cada paciente primarias aisladas de material de biopsia permitirá en las pruebas in vitro de estrategias terapéuticas. Tales sistemas de prueba hará posible investigar diferentes fármacos y combinaciones de los mismos en un tiempo-y cribado de alto rendimiento de ahorro de costes. Además, la integración de las células estromales asociadas a tumores como se muestra en este estudio es importante para el enfoque personalizado, ya que la progresión del tumor influencias del microentorno de un tumor 13 y podría resultar como suitable diana terapéutica. Alternativamente a un enfoque personalizado, nuestro modelo de tumor puede ser modificado para servir como un sistema de prueba de tumor generalizada por la incorporación de líneas celulares tumorigénicas establecidas. Se trata de una adaptación prometedora para fines de investigación básica. Por tanto las pruebas de drogas se acerca se requiere la presencia de una estructura vascular para probar la distribución y absorción de las sustancias terapéuticas. La matriz-SIS Muc permite la siembra basolateral con MVEC primaria para los estudios de barrera de absorción, la resiembra de las estructuras vasculares conservados de la BioVaSc mejorará aún más el estudio de la administración de fármacos. Con el fin de crear modelos de tejido, una matriz biodegradable 3D se puede utilizar como marco para un co-cultivo de diferentes tipos de células 14. El uso de tales matrices en 3D es a menudo limitada por la ausencia de una vascularización funcional. Este problema puede ser resuelto por el uso de la BioVaSc, que ofrece conservado str vaso sanguíneouctures, que puede ser resembrado con células endoteliales. Además, la BioVaSc proporciona componentes extracelulares, que aseguran la adherencia de las células y facilitar la diferenciación del tejido. También permite a la función específica de tejido de largo plazo de los tejidos bioartificiales 3D 7,8,15. El requisito previo para la ingeniería de sustitutos vasculares funcionales es la imitación de fisiológica humana y las condiciones biomecánicas. Por lo tanto, los sistemas de biorreactores, que pueden poner en práctica estos requisitos in vitro, son de gran interés para la creación de modelos de tumores biológicos. La combinación de la BioVaSc, la tecnología de biorreactor y el co-cultivo de diferentes tipos de células es un método muy prometedor para generar tejidos tumorales vascularizadas, lo que permitirá el estudio de los mecanismos pertinentes para la progresión del cáncer, como la angiogénesis y la metástasis. Vemos este tipo de modelos de tumores como un enfoque prometedor para complementar los estudios en animales al proporcionar un equivalentea la fisiología del tumor humano.

Nuevos productos farmacéuticos deben ser validadas en lo que respecta a su calidad, seguridad y eficacia antes de la autorización de comercialización. Hasta la fecha, los experimentos con animales son el método estándar para las pruebas de drogas y validación. Sin embargo, debido a las diferencias específicas de las especies, los experimentos con animales a menudo no ampliamente evaluar el efecto de los compuestos en los seres humanos 1. Por esta razón, es importante para generar modelos de tejidos humanos que se pueden utilizar para ensayos in vitro de nuevos medicamentos y sustancias. Uno de los ejes de nuestro grupo es la creación de modelos de ensayo in vitro in con nuestro andamio biológico vascularizado (BioVaSc) 2,3. El BioVaSc se puede utilizar como un sistema de matriz 3D estática o dinámica. Para la cultura estática, el segmento yeyunal porcino descelularizado (Small intestinal submucosa SIS-Muc) se coloca en un inserto de metal para la resiembra de la célula. Diversas células, como el cáncer y las células endoteliales se pueden cultivar en el andamio. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; Para el cultivo dinámico, la BioVaSc está unido a un sistema de biorreactor de flujo que se aplica a lo largo de la vasculatura o en toda la superficie del andamio. Biorreactores actuales aplicar estímulos biológicos, mecánicos, eléctricos o que actúan sobre la diferenciación o proliferación de las células 4. Para biorreactores en el campo de la ingeniería de tejidos, el concepto básico es para simular las condiciones en el cuerpo humano. En el que, las células se les proporciona un entorno natural en el que pueden interactuar entre sí y con su matriz extracelular circundante. Para la producción de sistemas in vitro o trasplantes de prueba en, la capacidad para imitar el entorno natural de las células con una estructura de soporte adecuada y un sistema biorreactor es crítico 5. Por lo tanto, los dispositivos más complejos y técnicamente exigentes deben desarrollarse con el fin de cumplir con estas tareas 6. Además, es posible utilizar nuestro andamiaje para el establdantes de un modelo vascularizado debido a las estructuras tubulares conservados, que incluyen la arteria de alimentación, vena, y la cama capilar de conexión. Todas las células de porcino necesitan ser eliminado por descelularización química, mecánica y enzimática, y la gamma-esterilizada andamio. Las estructuras vasculares tubulares restaurados posteriormente pueden volver a sembrarse con células endoteliales microvasculares humanas utilizando un biorreactor de perfusión de recirculación 7, que imita los parámetros biomecánicos y / o bioquímicas tales como el pH, la temperatura, la presión, el suministro de nutrientes y eliminación de desechos 6. El re-endotelización de las estructuras tubulares crea un humano equivalente de vasos sanguíneos dentro de la 3,7 andamio de colágeno. En el siguiente paso, la superficie de los antiguos lumen (mucosa) se puede sembrar con células humanas primarias para establecer co-cultivos 3,7,8. En este estudio un sistema de prueba de tumor 3D está configurado por el co-cultivo de una línea celular tumoral con vía primariacélulas ROMAL en condiciones estáticas y dinámicas en el SIS-Muc.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Name of the reagent</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalogue number</td>
			<td>Comments (optional)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Collagenase solution</td>
			<td>SERVA</td>
			<td>17454</td>
			<td>(500 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispase solution</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>17105-041</td>
			<td>(2.0 U/ml)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM, high-glucose</td>
			<td>PAA</td>
			<td>G0001,3010</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DNase</td>
			<td>ROCHE</td>
			<td>10104159001</td>
			<td>200 mg solved in 500 ml PBS+ + 1% PenStrep</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DZ solution</td>
			<td>Roth</td>
			<td>3484.2</td>
			<td>34 g Sodium Desoxychelate, in 1 L Ultra-pure water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FCS</td>
			<td>LONZA</td>
			<td>DE14-801F</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IHC-Kit DCS SuperVision 2 HRP</td>
			<td>DCS</td>
			<td>PD000KIT</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>medical pressure transducer</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>SP844</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>monoclonal mouse anti-human Von Willebrand Factor</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>M0616</td>
			<td>Clone F8/86 0.12 &mu;g/ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mouse monoclonal anti-human p53</td>
			<td>DAKO Cytomation</td>
			<td>IS616</td>
			<td>Clone DO-7 ready-to-use</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>peristaltic pump</td>
			<td>Ismatec</td>
			<td>&nbsp;</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sterile disposable dome</td>
			<td>MEMSCAP</td>
			<td>844-28</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypsin / EDTA solution</td>
			<td>PAA</td>
			<td>L11-003</td>
			<td>0,05%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VascuLife (VEGF-Mv)</td>
			<td>Lifeline</td>
			<td>LL-0003</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Versene</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>15040-033</td>
			<td>&nbsp;</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tissue engineering of a human 3d in vitro tumor test system

El cáncer es una de las principales causas de muerte en todo el mundo. Estrategias terapéuticas actuales se desarrollan principalmente en los sistemas de cultivo en 2D, que reflejen adecuadamente las condiciones fisiológicas in vivo. 3D matrices biológicas proporcionan células un ambiente en el cual las células pueden auto-organizarse, lo que permite el estudio de la organización del tejido y la diferenciación celular. Tales andamios se pueden sembrar con una mezcla de diferentes tipos de células para estudiar-interacciones célula-célula directos 3D. Para imitar la complejidad 3D de tumores de cáncer, nuestro grupo ha desarrollado un sistema de prueba 3D in vitro tumor. Nuestros modelos de sistemas de ensayo de tejido 3D la situación in vivo de tumores malignos de la vaina de los nervios periféricos (MPNSTs), que hemos establecido con nuestros descelularizado segmento yeyunal porcino andamio vascularizado biológico derivado (BioVaSc). En nuestro modelo, nos volvieron a sembrar una matriz BioVaSc modificado con fibroblastos primarios, células endoteliales microvasculares (MVECs) y la línea de células tumorales S462. Para la cultura estática, se retira la estructura vascular del BioVaSc y el andamio restante se corta en un lado (Intestino Delgado Submucosa SIS-Muc). La matriz resultante se fija entonces entre dos anillos de metal (coronas de células). Otra opción es la cultura el sembrado de células SIS-Muc en un sistema de biorreactor de flujo que expone las células a la tensión de cizallamiento. Aquí, el biorreactor está conectado a una bomba peristáltica en un incubador de auto-construido. Un equipo que regula el oxígeno arterial y el suministro de nutrientes a través de parámetros como la presión arterial, la temperatura y el caudal. Esta configuración permite una cultura dinámica, ya sea con pulsátil presión regulada o flujo constante. En este estudio, se podría establecer con éxito tanto un sistema de cultivo 3D estática y dinámica para MPNSTs. La capacidad de modelar los tumores de cáncer en un entorno 3D más natural permitirá el descubrimiento, prueba y validación defuturos fármacos en un modelo similar a la humana.

Como se muestra en la Figura 1B, es descelularizado el segmento yeyunal porcino (alrededor de 2 m de longitud y 20 mm de diámetro) con estructuras tubulares conservados de la red capilar. Después de química, enzimática y mecánica descelularización, se obtuvo un andamio de colágeno I / III, que puede ser utilizado para el cultivo celular en 3D. Se realizó una prueba de Feulgen para demostrar la pureza (no hay restos de ADN) de la matriz (no se muestran datos). Las Figuras 2A y 2B muestran la cultura estática del SIS-Muc asegurado por las coronas de células. Arreglamos el SIS-Muc en un biorreactor en el local diseñado (Figura 2C) para la cultura dinámica. Figura 2D ilustra el flujo dinámico simulado a través de la cámara del biorreactor. El biorreactor se coloca en un sistema de incubación de auto-construido y conectado con una bomba peristáltica. Esta configuración permite una cultura dinámica, ya sea con flujo pulsátil presión regulada o c<html> flujo onstante. La Figura 3 da una visión general de la línea de células cultivadas de forma estática S462 tumor en monocultivo 2D (Figura 3A) y en 3D co-cultivo (Figuras 3B-3D). Figura 3B muestra la triple cultivo de células tumorales S462 y fibroblastos primarios de la parte apical del SIS -Muc (ex equipo lumen interno) y MVEC en el lado basolateral (ex equipo serosa). La identificación de diferentes tipos de células es posible mediante la tinción de marcadores específicos de tipo celular, tales como el factor de von Willebrand para etiquetar MVEC (Figura 3C). Las células p53-S462 positivo se pueden distinguir de los fibroblastos primarios-p53 negativo (Figura 3D) y la distribución 3D de las células puede ser analizado. Figura 4 muestra tinciones equivalente a la Figura 3 de la cultura de triple dinámicamente cultivadas. <html> 0460/50460fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Descelularización puesta a punto. (A) biorreactor y la bomba de puesta a punto para la decellularizing BioVaSc, controlado por una PC. (B) Descelularizado BioVaSc en el tanque de vidrio. El lumen y la entrada arterial están conectados a los adaptadores. . <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig2.jpg" /> Figura 2. Sobre la opinión de los cultivos distintos reglajes. (A) vista en sección CAD ​​de sistema de cultivo estático en placa de microtitulación, (B) insertos metálicos para la cultura estática, (C) de simulación de flujo medio (campo de velocidad [m / s]) para la cultura dinámica de la tapa superior del biorreactor de flujo , (d) biorreactor de flujo para la cultura dinámica conectada a la bomba peristáltica. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig2large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> ent &quot;fo: keep-together.within-page =&quot; always &quot;&gt; <img alt="Figura 3" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig3highres.jpg" fo:content-width="5.5in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig3.jpg" /> Figura 3. Visión general de la caracterización inmunohistoquímico del tumor modelo 3D estática. (A) tinción con hematoxilina de la cultura mono 2D estáticamente cultivada de células S462 en un portaobjetos Permanox, (B) tinción con HE de la estáticamente cultivaron cultura de triple 3D, flechas marcan las células endoteliales, (C) tinción inmunohistoquímico para el factor de von Willebrand, (D ) tinción inmunohistoquímico de p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig3large.jpg" target="_blank">Haz clic aquí para ver más grande la figura</a> <img alt="Figura 4" fo:content-src="/files/ftp_upload/50460fig4highres.jpg" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50460/50460fig4.jpg" /> <strong&gt; Figura 4. Visión general de la caracterización inmunohistoquímico del tumor modelo 3D dinámico. (A) H &amp; E tinción de la dinámica cultura culta triples 3D, flechas marcan las células endoteliales, (B) tinción inmunohistoquímico para el factor de von Willebrand, (C) tinción inmunohistoquímico de p53. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50460/50460fig4large.jpg" target="_blank">Haz click aquí para ver más grande la figura</a>

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Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Se describen los métodos para crear los tejidos tumorales 3D humanos como sistemas de prueba. Estas tecnologías se basan en un descelularizado Biológica vascularizado Andamios (BioVaSc), las células humanas primarias y una línea de células tumorales, que pueden ser cultivadas bajo condiciones estáticas, así como en condiciones dinámicas en un biorreactor de flujo.

Ingeniería de tejidos de un humano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema de Prueba de Tumores

Cancer is one of the leading causes of death worldwide.  Current therapeutic strategies are predominantly developed in 2D culture  systems, which ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

21.2K vistas.  University Hospital Würzburg.  Se describen los métodos para crear los tejidos tumorales 3D humanos como sistemas de prueba. Estas tecnologías se basan en un descelularizado Biológica vascularizado Andamios (BioVaSc), las células humanas primarias y una línea de células tumorales, que pueden ser cultivadas bajo condiciones estáticas, así como en condiciones dinámicas en un biorreactor de flujo. 

Video: Tissue Engineering of a Human 3D in vitro Tumor Test System

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Ingeniería de tejidos: Construcción de un multicelular 3D Andamios para la entrega de láminas de células en capas

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Investigación

Bioingeniería

Tissue Engineering of Tumor Stromal Microenvironment with Application to Cancer Cell Invasion

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and invasion. Rat tail type I collagen and/or matrix derived from Engelbreth-Holm-Swarm mouse sarcoma cells have been traditionally employed as the substrates to model the matrix or stromal microenvironment into which mesenchymal cells (usually fibroblasts) are populated. Although experiments using such matrices are very informative, it can be argued that due to an overriding presence of a single protein (such as in type I Collagen) or a high content of basement membrane components and growth factors (such as in matrix derived from mouse sarcoma cells), these substrates do not best reflect the contribution to matrix composition made by the stromal cells themselves. To study native matrices produced by primary dermal fibroblasts isolated from patients with a tumor prone, genetic blistering disorder (recessive dystrophic epidermolysis bullosa), we have adapted an existing native matrix protocol to study tumor cell invasion. Fibroblasts are induced to produce their own matrix over a prolonged period in culture. This native matrix is then detached from the culture dish and epithelial cells are seeded onto it before the entire coculture is raised to the air-liquid interface. Cellular differentiation and/or invasion can then be assessed over time. This technique provides the ability to assess epithelial-mesenchymal cell interactions in a 3D setting without the need for a synthetic or foreign matrix with the only disadvantage being the prolonged period of time required to produce the native matrix. Here we describe the application of this technique to assess the ability of a single molecule expressed by fibroblasts, type VII collagen, to inhibit tumor cell invasion.

Tissue engineered fibroblast-derived native matrix is an emerging tool to generate a stromal substrate which supports epithelial cell proliferation and differentiation. Here a protocol applying this methodology to assess the impact of different stromal cell types on tumor cell biology is presented.

Ingeniería de tejidos de tumor del estroma Microambiente con Aplicación a la invasión de células cancerosas

3D organotypic cultures of epithelial cells on a matrix embedded with mesenchymal cells are widely used to study epithelial cell differentiation and ...

Production, Characterization and Potential Uses of a 3D Tissue-engineered Human Esophageal Mucosal Model

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore esophageal adenocarcinoma generally has a poor prognosis, with little improvement in survival rates in recent years. These are difficult conditions to study and there has been a lack of suitable experimental platforms to investigate disorders of the esophageal mucosa.
A model of the human esophageal mucosa has been developed in the MacNeil laboratory which, unlike conventional 2D cell culture systems, recapitulates the cell-cell and cell-matrix interactions present in vivo and produces a mature, stratified epithelium similar to that of the normal human esophagus. Briefly, the model utilizes non-transformed normal primary human esophageal fibroblasts and epithelial cells grown within a porcine-derived acellular esophageal scaffold. Immunohistochemical characterization of this model by CK4, CK14, Ki67 and involucrin staining demonstrates appropriate recapitulation of the histology of the normal human esophageal mucosa.
This model provides a robust, biologically relevant experimental model of the human esophageal mucosa. It can easily be manipulated to investigate a number of research questions including the effectiveness of pharmacological agents and the impact of exposure to environmental factors such as alcohol, toxins, high temperature or gastro-esophageal refluxate components. The model also facilitates extended culture periods not achievable with conventional 2D cell culture, enabling, inter alia, the study of the impact of repeated exposure of a mature epithelium to the agent of interest for up to 20 days. Furthermore, a variety of cell lines, such as those derived from esophageal tumors or Barrett&#8217;s Metaplasia, can be incorporated into the model to investigate processes such as tumor invasion and drug responsiveness in a more biologically relevant environment.

This manuscript describes the production, characterization and potential uses of a tissue engineered 3D esophageal construct prepared from normal primary human esophageal fibroblast and squamous epithelial cells seeded within a de-cellularized porcine scaffold. The results demonstrate the formation of a mature stratified epithelium similar to the normal human esophagus.

Producción, Caracterización y posibles usos de un Humano esofágica mucosas Modelo ingeniería tisular 3D

The incidence of both esophageal adenocarcinoma and its precursor, Barrett&#8217;s Metaplasia, are rising rapidly in the western world. Furthermore ...

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

Ingeniería 3D Cellularized colágeno Geles para Vascular Regeneración Tisular

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

Eye Irritation Test (EIT) for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial (RhCE) Tissue Model

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and accurate assessment of ocular toxicity in man are needed. To address this need, we have developed an eye irritation test (EIT) which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model that is based on normal human cells. The EIT is able to separate ocular&#160;irritants and corrosives (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category). The test utilizes two separate protocols, one designed for liquid chemicals and a second, similar protocol for solid test articles. The EIT prediction model uses a single exposure period (30 min for liquids, 6 hr for solids) and a single tissue viability cut-off (60.0% as determined by the MTT assay). Based on the results for 83 chemicals (44 liquids and 39 solids) EIT achieved 95.5/68.2/ and 81.8% sensitivity/specificity and accuracy (SS&#38;A) for liquids, 100.0/68.4/ and 84.6% SS&#38;A for solids, and 97.6/68.3/ and 83.1% for overall SS&#38;A. The EIT will contribute significantly to classifying the ocular irritation potential of a wide range of liquid and solid chemicals without the use of animals to meet regulatory testing requirements. The EpiOcular EIT method was implemented in 2015 into the OECD Test Guidelines as TG 492.

Eye Irritation Test EIT for Hazard Identification of Eye Irritating Chemicals using Reconstructed Human Cornea-like Epithelial RhCE Tissue Model

We have developed an eye irritation test which utilizes a three dimensional reconstructed human cornea-like epithelial (RhCE) tissue model. The test is able to discriminate between ocular irritant and corrosive materials (GHS Categories 1 and 2 combined) and those that do not require labeling (GHS No Category).

Irritación de los ojos de prueba (IET) para la identificación del peligro de los ojos: Irrita los productos químicos que utilizan Reconstruido humana Córnea-como epitelial (RHCE) Modelo de Tejidos

To comply with the Seventh Amendment to the EU Cosmetics Directive and EU REACH legislation, validated non-animal alternative methods for reliable and ...

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific mutational background. The model is generated on a decellularized porcine scaffold that reproduces tissue-specific characteristics regarding extracellular matrix composition and architecture including the basement membrane. We standardized a protocol that allows artificial tumor tissue generation within 14 days including three days of drug treatment. Our article provides several detailed descriptions of 3D read-out screening techniques like the determination of the proliferation index Ki67 staining&#39;s, apoptosis from supernatants by M30-ELISA and assessment of epithelial to mesenchymal transition (EMT), which are helpful tools for evaluating the effectiveness of therapeutic compounds. We could show compared to 2D culture a reduction of proliferation in our 3D tumor model that is related to the clinical situation. Despite of this lower proliferation, the model predicted EGFR-targeted drug responses correctly according to the biomarker status as shown by comparison of the lung carcinoma cell lines HCC827 (EGFR -mutated, KRAS wild-type) and A549 (EGFR wild-type, KRAS-mutated) treated with the tyrosine-kinase inhibitor (TKI) gefitinib. To investigate drug responses of more advanced tumor cells, we induced EMT by long-term treatment with TGF-beta-1 as assessed by vimentin/pan-cytokeratin immunofluorescence staining. A flow-bioreactor was employed to adjust culture to physiological conditions, which improved tissue generation. Furthermore, we show the integration of drug responses upon gefitinib treatment or TGF-beta-1 stimulation - apoptosis, proliferation index and EMT - into a Boolean in silico model. Additionally, we explain how drug responses of tumor cells with a specific mutational background and counterstrategies against resistance can be predicted. We are confident that our 3D in vitro approach especially with its in silico expansion provides an additional value for preclinical drug testing in more realistic conditions than in 2D cell culture.

A Combined 3D Tissue Engineered In Vitro/In Silico Lung Tumor Model for Predicting Drug Effectiveness in Specific Mutational Backgrounds

We present a three-dimensional (3D) lung cancer model based on a biological collagen scaffold to study sensitivity towards non-small-cell-lung-cancer-(NSCLC)-targeted therapies. We demonstrate different read-out techniques to determine the proliferation index, apoptosis and epithelial-mesenchymal transition (EMT) status. Collected data are integrated into an in silico model for prediction of drug sensitivity.

Un Tejido Combinada 3D Diseñado<em&gt; In Vitro</em&gt; /<em&gt; In silico</em&gt; Modelo de tumor de pulmón para la predicción de la eficacia de drogas en Fondos Específicos mutacional

In the present study, we combined an in vitro 3D lung tumor model with an in silico model to optimize predictions of drug response based on a specific ...

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and trade one defect for another. Tissue engineering holds the promise to address this increasing demand. However, most tissue engineering strategies fail to generate stable and functional tissue substitutes because of poor vascularization. This paper focuses on an in vivo tissue engineering chamber model of intrinsic vascularization where a perfused artery and a vein either as an arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration is directed inside a protected hollow chamber. In this chamber-based system angiogenic sprouting occurs from the arteriovenous vessels and this system attracts ischemic and inflammatory driven endogenous cell migration which gradually fills the chamber space with fibro-vascular tissue. Exogenous cell/matrix implantation at the time of chamber construction enhances cell survival and determines specificity of the engineered tissues which develop. Our studies have shown that this chamber model can successfully generate different tissues such as fat, cardiac muscle, liver and others. However, modifications and refinements are required to ensure target tissue formation is consistent and reproducible. This article describes a standardized protocol for the fabrication of two different vascularized tissue engineering chamber models in vivo.

Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber

This is a guideline for constructing in vivo vascularized tissue using a microsurgical arteriovenous loop or a flow-through pedicle configuration inside a tissue engineering chamber. The vascularized tissues generated can be employed for organ regeneration and replacement of tissue defects, as well as for drug testing and disease modeling.

Ingeniería de tejidos por intrínseca Vascularización en una<em&gt; En Vivo</em&gt; Cámara Ingeniería de Tejidos

In reconstructive surgery, there is a clinical need for an alternative to the current methods of autologous reconstruction which are complex, costly and ...

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing the complicated multi-bracket appliances to a simple two-bracket system for the purpose of force system evaluation will be the first step in this direction. However, much of the orthodontic biomechanics in this regard is confined to 2D experimental studies, computer modeling/analysis or theoretical extrapolation of existing models. The objective of this protocol is to design, construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the forces and moments generated by an archwire with a V-bend placed between two brackets. Additional objectives are to compare the force system generated by different types of archwires among themselves and to previous models. For this purpose, a 2 x 4 appliance representing a molar and an incisor has been simulated. An orthodontic wire tester (OWT) is constructed consisting of two multi-axis force transducers or load cells (nanosensors) to which the orthodontic brackets are attached. The load cells are capable of measuring the force system in all the three planes of space. Two types of archwires, stainless-steel and beta-titanium of three different sizes (0.016 x 0.022 inch, 0.017 x 0.025 inch and 0.019 x 0.025 inch), are tested. Each wire receives a single vertical V-bend systematically placed at a specific position with a predefined angle. Similar V-bends are replicated on different archwires at 11 different locations between the molar and incisor attachments. This is the first time an attempt has been made in vitro to simulate an orthodontic appliance utilizing V-bends on different archwires.

Force System with Vertical V-Bends: A 3D In Vitro Assessment of Elastic and Rigid Rectangular Archwires

The method presented here is designed to construct and validate an in vitro 3D model capable of measuring the force system generated by different archwires with V-bends placed between two brackets. Additional objectives are to compare this force system with different types of archwires and to previous models.

Sistema Vertical V-se dobla la fuerza: una evaluación 3D In Vitro de arcos rectangulares rígidos y elásticos

A proper understanding of the force system created by various orthodontic appliances can make treatment of patients efficient and predictable. Reducing ...

A Human 3D Extracellular Matrix-Adipocyte Culture Model for Studying Matrix-Cell Metabolic Crosstalk

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of cellular function. The ECM plays a particularly important role in adipose tissue function in obesity, and alterations in adipose tissue ECM deposition and composition are associated with metabolic disease in mice and humans. Tractable in vitro models that permit dissection of the roles of the ECM and cells in contributing to global tissue phenotype are sparse. We describe a novel 3D in vitro model of human ECM-adipocyte culture that permits study of the specific roles of the ECM and adipocytes in regulating adipose tissue metabolic phenotype. Human adipose tissue is decellularized to isolate ECM, which is subsequently repopulated with preadipocytes that are then differentiated within the ECM into mature adipocytes. This method creates ECM-adipocyte constructs that are metabolically active and retain characteristics of the tissues and patients from which they are derived. We have used this system to demonstrate disease-specific ECM-adipocyte crosstalk in human adipose tissue. This culture model provides a tool for dissecting the roles of the ECM and adipocytes in contributing to global adipose tissue metabolic phenotype and permits study of the role of the ECM in regulating adipose tissue homeostasis.

We describe a 3D human extracellular matrix-adipocyte in vitro culture system that permits dissection of the roles of the matrix and adipocytes in contributing to adipose tissue metabolic phenotype.

Un modelo de cultivo de matriz-adipocitos extracelulares 3D humano para el estudio de la conversación cruzada metabólica Matrix-Cell

The extracellular matrix (ECM) plays a central role in regulating tissue homeostasis, engaging in crosstalk with cells and regulating multiple aspects of ...

Developing 3D Organized Human Cardiac Tissue within a Microfluidic Platform

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart muscle, the myocardium, is notoriously difficult to accomplish in vitro. Mainly, obstacles lie in the need for human cardiomyocytes (CMs) that are either adult or exhibit adult-like phenotypes and can successfully replicate the myocardium&#39;s cellular complexity and intricate 3D architecture. Unfortunately, due to ethical concerns and lack of available primary patient-derived human cardiac tissue, combined with the minimal proliferation of CMs, the sourcing of viable human CMs has been a limiting step for cardiac tissue engineering. To this end, most research has transitioned toward cardiac differentiation of human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) as the primary source of human CMs, resulting in the wide incorporation of hiPSC-CMs within in vitro assays for cardiac tissue modeling.
Here in this work, we demonstrate a protocol for developing a 3D mature stem cell-derived human cardiac tissue within a microfluidic device. We specifically explain and visually demonstrate the production of a 3D in vitro anisotropic cardiac tissue-on-a-chip model from hiPSC-derived CMs. We primarily describe a purification protocol to select for CMs, the co-culture of cells with a defined ratio via mixing CMs with human CFs (hCFs), and suspension of this co-culture within the collagen-based hydrogel. We further demonstrate the injection of the cell-laden hydrogel within our well-defined microfluidic device, embedded with staggered elliptical microposts that serve as surface topography to induce a high degree of alignment of the surrounding cells and the hydrogel matrix, mimicking the architecture of the native myocardium. We envision that the proposed 3D anisotropic cardiac tissue-on-chip model is suitable for fundamental biology studies, disease modeling, and, through its use as a screening tool, pharmaceutical testing.

The goal of this protocol is to explain and demonstrate the development of a three-dimensional (3D) microfluidic model of highly aligned human cardiac tissue, composed of stem cell-derived cardiomyocytes co-cultured with cardiac fibroblasts (CFs) within a biomimetic, collagen-based hydrogel, for applications in cardiac tissue engineering, drug screening, and disease modeling.

Desarrollo de tejido cardíaco humano organizado en 3D dentro de una plataforma microfluídica

The leading cause of death worldwide persists as cardiovascular disease (CVD). However, modeling the physiological and biological complexity of the heart ...