Este protocolo demuestra las condiciones necesarias para mantener la función retiniana en ERG ex vivo, particularmente la onda B extremadamente sensible producida por las células ON-bipolares. Con ERG ex vivo, podemos medir la función de diferentes tipos de neuronas retinianas con una alta relación señal/ruido al tiempo que permitimos la fácil introducción de agentes farmacológicos. Este método es particularmente susceptible de cuantificar la eficacia de los agentes farmacológicos sobre la función retiniana y la enfermedad.
Para comenzar, convierta una configuración de matriz de electrodos múltiples conectando el soporte de muestra ERG ex vivo a un amplificador diferencial a través de un headstage. El amplificador debe estar conectado a la entrada analógica de la placa de interfaz del sistema de matriz de electrodos múltiples. Utilice el software de grabación para la matriz de electrodos múltiples para registrar y almacenar los datos de entrada del ERG ex vivo.
Ajuste la ganancia del amplificador diferencial a 100 y agregue una amplificación de voltaje adicional de 10X, dependiendo de las especificaciones del digitalizador. Ajuste el filtro de paso bajo a 100 hercios. Alternativamente, para convertir una configuración de abrazadera de parche, conecte el portamuestras ERG ex vivo a través de un escenario de cabeza a un amplificador diferencial, que debe conectarse al escenario de cabeza del amplificador de abrazadera de parche.
Utilice el software del sistema de abrazadera de conexión y el digitalizador para registrar y almacenar los datos de entrada del ERG ex vivo. Establezca los parámetros como se muestra anteriormente. Conecte los LED con las longitudes de onda apropiadas al microscopio.
Para controlar los estímulos de luz, utilice un controlador LED controlado por salidas analógicas desde un digitalizador. Controle los LED con un software de grabación que permitirá la activación de estímulos de luz. Luego, calibre la salida de luz de los LED en la posición de la retina en el portamuestras utilizando un fotodiodo.
Si es necesario, inserte filtros de densidad neutra para atenuar la intensidad de la luz en la trayectoria de la luz. Para preparar el electrodo, inserte un electrodo de pellets de cloruro de plata y plata en un conector de señuelo roscado. Llene el interior del conector del señuelo con pegamento caliente e inserte un zócalo de dos milímetros en el pegamento caliente desde el lado no roscado.
Suelde un cable plateado del electrodo EP-1 al zócalo de dos milímetros. Atornille el electrodo terminado con una junta tórica en la rosca en los puertos del electrodo del portamuestras ERG ex vivo. Para los ojos grandes, incluidos los ojos de donantes humanos, limpie el globo del tejido conectivo restante y retire el segmento anterior y el cristalino.
Use un bisturí para hacer un corte aproximadamente a tres milímetros del limbo. Inserte tijeras de disección curvas en la incisión y corte a lo largo del limbo para extraer la porción anterior del ojo con la lente. Obtenga muestras de retina para electrorretinografía ex vivo con un punzón de biopsia desechable de tres a seis milímetros.
Para montar el tejido en el portamuestras, coloque la mitad inferior del portamuestras en una placa de Petri grande y llénela con medio de Ames oxigenado de tal manera que la cúpula del portamuestras quede sumergida. Agarre cuidadosamente el borde de la retina con pinzas finas y transfiera la retina a la cúpula del portamuestras ex vivo, con el lado del fotorreceptor hacia arriba. Levante el portamuestras de la solución de Ames, teniendo cuidado de que la retina permanezca en su lugar.
Seque completamente la placa del portamuestras para minimizar el ruido, la diafonía eléctrica y la derivación de señales. Luego ensamble ambas mitades del portamuestras con cuatro tornillos y conecte la línea de perfusión. Conduzca el electrodo en la mitad inferior del portamuestras y conecte el cable del ánodo al lado interno de la retina y el cable del cátodo al lado fotorreceptor.
Perfundir el portamuestras con al menos un mililitro por minuto de medio Ames oxigenado durante 10 a 20 minutos para permitir que las respuestas de luz se estabilicen. Ex vivo ERG permitió el registro de las respuestas de luz de los fotorreceptores y las células bipolares ON de la retina del ratón. El registro de las respuestas de los fotorreceptores de las retinas de donantes humanos fue posible con un retraso postmortem de hasta cinco horas de la enucleación y menos de 20 minutos de retraso para las respuestas de las células ON-bipolares.
En condiciones ideales, las amplitudes de respuesta y la cinética en ambos tipos de células fueron relativamente estables a lo largo del tiempo, pero mostraron una disminución lenta de 40 a 45 minutos después de que las retinas se montaron en el portamuestras. La temperatura reducida en el portamuestras ralentizó en gran medida la cinética tanto de los fotorreceptores como de las células bipolares ON. Sin embargo, disminuyó la amplitud de la onda B pero no la onda A.
Por el contrario, la disminución de la velocidad de perfusión redujo las amplitudes de las respuestas de los fotorreceptores y de las células bipolares ON, pero no afectó el tiempo implícito de la onda A o B. El cese de la perfusión durante 10 minutos seguido de la reperfusión dio lugar a una pérdida completa de la función de las células bipolares ON con respuestas fotorreceptoras preservadas. La velocidad de perfusión y la temperatura fisiológica suficientes son fundamentales para obtener respuestas estables, en particular, de las células bipolares ON en el ERG ex vivo.
Este protocolo permite explorar en profundidad las diferencias en la función de los fotorreceptores en la mácula y la periferia humana, respondiendo a preguntas que antes solo podían llevarse a cabo en primates no humanos.
