يوضح هذا البروتوكول الشروط اللازمة للحفاظ على وظيفة الشبكية في ERG خارج الجسم الحي ، وخاصة الموجة B الحساسة للغاية التي تنتجها خلايا ON-bipolar. باستخدام ex vivo ERG ، يمكننا قياس وظيفة أنواع مختلفة من الخلايا العصبية في شبكية العين مع نسبة إشارة عالية إلى الضوضاء مع السماح بإدخال العوامل الدوائية بسهولة. هذه الطريقة قابلة بشكل خاص لتحديد فعالية العوامل الدوائية على وظيفة الشبكية والمرض.
للبدء ، قم بتحويل إعداد صفيف متعدد الأقطاب الكهربائية عن طريق توصيل حامل عينة ERG خارج الجسم الحي بمكبر صوت تفاضلي عبر ضاليعة. يجب توصيل مكبر الصوت بالإدخال التناظري للوحة الواجهة لنظام الصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية. استخدم برنامج التسجيل للصفيف متعدد الأقطاب الكهربائية لتسجيل وتخزين بيانات الإدخال من ex vivo ERG.
اضبط كسب مكبر الصوت التفاضلي على 100 وأضف تضخيم جهد إضافي 10X ، اعتمادا على مواصفات محول الأرقام الرقمية. اضبط مرشح التمرير المنخفض على 100 هرتز. بدلا من ذلك ، لتحويل إعداد مشبك التصحيح ، قم بتوصيل حامل عينة ERG خارج الجسم الحي عبر مرحلة متقدمة بمكبر صوت تفاضلي ، والذي يجب توصيله بمرحلة مضخم مشبك التصحيح.
استخدم برنامج نظام مشبك التصحيح ومحول الأرقام لتسجيل وتخزين بيانات الإدخال من ex vivo ERG. اضبط المعلمات كما هو موضح سابقا. قم بتوصيل مصابيح LED بأطوال موجية مناسبة بالمجهر.
للتحكم في محفزات الضوء ، استخدم برنامج تشغيل LED يتم التحكم فيه بواسطة مخرجات تناظرية من محول رقمي. تحكم في مصابيح LED باستخدام برنامج التسجيل الذي سيمكن من تشغيل محفزات الضوء. بعد ذلك ، قم بمعايرة ناتج الضوء لمصابيح LED في موضع شبكية العين في حامل العينة باستخدام الصمام الثنائي الضوئي.
إذا لزم الأمر ، أدخل مرشحات الكثافة المحايدة لتعتيم شدة الضوء في مسار الضوء. لتحضير القطب ، أدخل قطب كهربائي من حبيبات كلوريد الفضة في موصل إغراء ملولب. املأ الجزء الداخلي من موصل الإغراء بالغراء الساخن ، وأدخل مقبس 2 ملم في الغراء الساخن من الجانب غير الملولب.
لحام سلك فضي من القطب EP-1 إلى مقبس اثنين ملليمتر. قم بربط القطب النهائي بحلقة O على الخيط في منافذ القطب لحامل عينة ERG خارج الجسم الحي. بالنسبة للعيون الكبيرة ، بما في ذلك عيون المتبرعين بالبشر ، قم بتنظيف الكرة الأرضية من النسيج الضام المتبقي وإزالة الجزء الأمامي والعدسة.
استخدم مشرطا لعمل قطع حوالي ثلاثة ملليمترات من الليمبوس. أدخل مقص تشريح منحني في الشق واقطعه على طول الحافة لإزالة الجزء الأمامي من العين بالعدسة. الحصول على عينات شبكية العين لتخطيط كهربية الشبكية خارج الجسم الحي مع لكمة خزعة يمكن التخلص منها من ثلاثة إلى ستة ملليمترات.
لتركيب الأنسجة على حامل العينة ، ضع النصف السفلي من حامل العينة في طبق بتري كبير ، واملأه بوسط أميس المؤكسج بحيث تكون قبة حامل العينة مغمورة للتو. أمسك بعناية حافة الشبكية بالملقط الدقيق وانقل الشبكية إلى قبة حامل العينة خارج الجسم الحي ، وجانب المستقبلات الضوئية متجها لأعلى. ارفع حامل العينة من محلول أميس ، مع الحرص على بقاء شبكية العين في مكانها.
جفف لوحة حامل العينة تماما لتقليل الضوضاء والحديث الكهربائي وتحويل الإشارة. ثم قم بتجميع نصفي حامل العينة بأربعة براغي وقم بتوصيل خط التروية. قم بقيادة القطب في النصف السفلي من حامل العينة وقم بتوصيل كابل الأنود بجانب الشبكية الداخلي وكابل الكاثود بجانب المستقبلات الضوئية.
قم بتزويد حامل العينة بما لا يقل عن ملليلتر واحد في الدقيقة من وسط Ames المؤكسج لمدة 10 إلى 20 دقيقة للسماح باستقرار استجابات الضوء. مكن Ex vivo ERG من تسجيل المستقبلات الضوئية واستجابات ضوء الخلية ثنائية القطب من شبكية الفأر. كان تسجيل استجابات المستقبلات الضوئية من شبكية العين من متبرع بشري ممكنا مع تأخير يصل إلى خمس ساعات بعد الوفاة من الاستئصال وأقل من 20 دقيقة تأخير لاستجابات الخلايا ثنائية القطب ON.
في ظل الظروف المثالية ، كانت سعة الاستجابة والحركية في كلا النوعين من الخلايا مستقرة نسبيا بمرور الوقت ، لكنها أظهرت انخفاضا بطيئا بعد 40 إلى 45 دقيقة من تركيب شبكية العين على حامل العينة. أدى انخفاض درجة الحرارة في حامل العينة إلى إبطاء حركية كل من مستقبلات الصور والخلايا ثنائية القطب ON. ومع ذلك ، فقد قلل من سعة الموجة B ولكن ليس الموجة A.
على العكس من ذلك ، أدى إبطاء معدل الإرواء إلى تقليل سعة كل من مستقبلات الصورة واستجابات الخلايا ثنائية القطب ON-القطب، ولكنه لم يؤثر على الوقت الضمني للموجة A أو B. أدى وقف التروية لمدة 10 دقائق متبوعا بإعادة التروية إلى فقدان كامل لوظيفة الخلية ثنائية القطب مع استجابات مستقبلات ضوئية محفوظة. تعد سرعة التروية الكافية ودرجة الحرارة الفسيولوجية أمرا بالغ الأهمية للحصول على استجابات مستقرة ، على وجه الخصوص ، من الخلايا ثنائية القطب ON-القطب.
يسمح هذا البروتوكول بالاستكشاف المتعمق للاختلافات في وظيفة المستقبلات الضوئية في البقعة الصفراء البشرية والأطراف ، والإجابة على الأسئلة التي لم يكن من الممكن إجراؤها في السابق إلا في الرئيسيات غير البشرية.
