El método de autoinducción libre de células reduce la supervisión del investigador y el tiempo necesario para producir extractos celulares funcionales. Esto simplifica los protocolos previos de síntesis de proteínas in vitro que consumían más tiempo e intensidad. Esta técnica es menos complicada y también de alto rendimiento, lo que permitirá a una audiencia más grande implementar la expresión libre de células.
Este método destaca la importancia del metabolismo energético durante el crecimiento celular y dentro de las reacciones libres de células. Comience por preparar 960 mililitros de medios de autoinducción libres de células. Luego, esterilice el medio en un matraz desconcertado de 2.5 litros en autoclave durante 30 minutos a 121 grados centígrados.
A continuación, después de preparar 40 mililitros de la solución de azúcar, filtre y esterilice en un recipiente de vidrio en autoclave separado. Después del autoclave, cuando el medio de cultivo se haya enfriado por debajo de 40 grados centígrados, agregue la solución de azúcar esterilizada por filtro directamente al medio. A continuación, inocule los medios deslizando un bucle lleno de colonias de una placa estrella E.coli BL21 fresca previamente rayada e insertando el bucle directamente en el medio.
Gire el bucle en el medio sin tocar los lados del contenedor. Luego, coloque el medio inoculado durante la noche en una incubadora de 30 grados Celsius con agitación a 200 RPM. Al día siguiente, cosecha las células transfiriendo un litro del medio a una botella de centrífuga de un litro y centrifugando a 5.000 veces G entre cuatro y 10 grados centígrados durante 10 minutos.
Después de desechar el sobrenadante, use una espátula estéril para transferir el pellet a un tubo cónico de 50 mililitros preenfriado y previamente pesado. A continuación, lave el pellet una vez con 30 a 40 mililitros de tampón S30 frío resuspiendo el pellet a través del vórtice en ráfagas de 30 segundos con períodos de descanso en hielo. Después de que el pellet esté completamente resuspendido, centrifugue la resuspensión celular, deseche el sobrenadante y, con un pañuelo limpio, limpie cualquier exceso de sobrenadante de las paredes internas del tubo de 50 mililitros sin tocar el pellet.
Luego, pese el pellet antes de congelarlo en nitrógeno líquido y guárdelo a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Para preparar el extracto celular, agregue un mililitro de tampón S30 por gramo del pellet de célula congelado y permita que el pellet se descongele en hielo durante 30 a 60 minutos. Luego, vuelva a suspender el pellet descongelado a través de vórtices en ráfagas de 30 segundos con períodos de descanso en hielo hasta que no queden grupos de células visibles.
Para la lisis celular, transfiera 1,4 alícuotas de mililitros de la suspensión celular a tubos de microfugios de 1,5 mililitros. Luego, sonice la suspensión celular en cada tubo con una frecuencia de 20 kilohercios y 50% de amplitud durante tres ráfagas de 45 segundos con 59 segundos de reposo por ciclo en un baño de hielo Invierta el tubo entre ciclos, y después del último ciclo de sonicación, agregue inmediatamente 4.5 microlitros de ditiotreitol monolar. Después de sonicar la suspensión celular en todos los tubos, centrífuga los tubos y recoger el sobrenadante en alícuotas de 600 microlitros en tubos de microfugio frescos de 1,5 mililitros.
Congela y almacena las alícuotas a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior. Para realizar 15 microlitros de reacción de síntesis de proteínas libres de células en tubos de microfugios de 1,5 mililitros en cuadruplicato, descongele una alícuota del extracto celular. Después de preparar cada mezcla de reacción de 15 microlitros, deje que la reacción se ejecute durante al menos cuatro horas a 37 grados centígrados.
Para cuantificar la proteína reportera, combine 48 microlitros de tampón HEPES de 50 milimolares a pH 7.2 con dos microlitros de cada producto de reacción de síntesis de proteínas libres de células en una placa de poliestireno negro de 96 pocillos. Cuantificar la intensidad de fluorescencia de la proteína fluorescente verde supercarpeta, o sfGFP, utilizando una longitud de onda de excitación de 485 y una longitud de onda de emisión de 528 nanómetros. Luego, convierta las unidades de fluorescencia relativas al rendimiento volumétrico de sfGFP creando una curva estándar utilizando el plásmido pJL1 sfGFP purificado.
Aquí se muestran gránulos de medios de autoinducción libres de células después de la cosecha celular a diferentes densidades ópticas medidas a 600 nanómetros. El medio cultivado a una densidad óptica de 10 produjo una mayor cantidad de pellet celular en el extracto general que el medio cultivado a una densidad óptica de 2.5. Un análisis adicional de la concentración total de proteínas no demostró diferencias significativas en la proteína general entre ambos extractos.
A pesar de que el medio se cultivó a diferentes niveles de densidad óptica, ambos extractos demostraron resultados similares en reacciones libres de células que expresan sfGFP. Mantener condiciones estériles mientras se preparan los medios y la solución de azúcar es importante. Este método de extracto celular CFAI se puede utilizar para la mayoría de las aplicaciones de expresión libre de células.
Estos van desde la educación en biotecnología hasta la ingeniería de proteínas, así como el diagnóstico en el punto de atención. Este método reduce la cantidad de tiempo y la habilidad técnica requerida, mejora la reproducibilidad y produce mayores cantidades de extracto.
