Los ensayos basados en TR-FRET proporcionan nuevas herramientas rentables para el cribado y la caracterización farmacológica de moduladores específicos y selectivos de las vías de señalización JAK/STAT. Esta técnica es mucho más fácil, rápida, reproducible y robusta que los métodos convencionales como Western blot y ELISA. No se requieren pasos de lavado y los reactivos se agregan en un solo paso.
Esta plataforma de inmunoensayo se puede aplicar fácilmente a otras proteínas de señalización celular siempre que se disponga de anticuerpos específicos. Para diseñar ensayos reproducibles, debe utilizar buenas prácticas de cultivo celular y establecer procedimientos operativos estándar. Además, debe optimizar cuidadosamente las condiciones de cultivo y tratamiento celular.
Demostrando el procedimiento estará Genevieve Chatel, una científica de nuestro laboratorio. Para comenzar, cultive células HeLa y A431 en una incubadora humidificada de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono utilizando DMEM complementado con 10% FBS. Cuando las células alcancen el 70 a 80% de confluencia, tripsinícelas y páselas o úselas para ensayos.
Para realizar el ensayo, dispense 50 microlitros de células a la densidad preoptimizada en una placa tratada con cultivo de tejidos de 96 pocillos en el medio de cultivo apropiado, luego incube durante la noche en una incubadora de 37 grados Celsius y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, prepare series intermedias de dilución doble y cuádruple de los compuestos de prueba diluyendo en serie el compuesto en un medio libre de suero en 12 pocillos de una placa de polipropileno de 96 pocillos. Para la estimulación celular, agregue 50 microlitros de medio libre de suero que contenga el simulador a una concentración de 2X e incube las células durante el tiempo preoptimizado a temperatura ambiente o 37 grados.
Para la inhibición celular, agregue 25 microlitros de medio libre de suero que contenga el inhibidor a una concentración de 4X e incube las células durante el tiempo preoptimizado a temperatura ambiente o 37 grados, luego agregue 25 microlitros de medio libre de suero que contenga el estimulador a una concentración de 4X e incube durante el tiempo preoptimizado. A continuación, para lisar las células, prepare el tampón de lisis suplementado 1X y agréguele un cóctel inhibidor de la fosfatasa. Después de retirar y desechar cuidadosamente el medio de cultivo celular, agregue inmediatamente 50 microlitros del tampón de lisis suplementado 1X preparado e incube durante 30 minutos a temperatura ambiente bajo agitación con agitación moderada.
Para la detección TR-FRET, prepare la mezcla de detección de anticuerpos 4X en el tampón de detección 1X, luego prepare las soluciones de anticuerpos EUAB1 y FRAB2, así como las soluciones de anticuerpos EUAB3 y FRAB4 en el tampón de detección 1X. Finalmente, mezcle EUAB1 prediluido con FRAB2 prediluido para la detección de fosfoproteína y EUAB3 prediluido y FRAB4 prediluido para la detección de proteína total. Luego, pipetee cuidadosamente 15 microlitros del lisado celular de la placa de cultivo de 96 pocillos a un pozo de una microplaca blanca de bajo volumen de 384 pocillos.
A continuación, agregue 15 microlitros del lisado de control positivo y 15 microlitros de tampón de lisis 1X como control negativo para separar los pozos de ensayo. A los pocillos que contienen 15 microlitros del lisado, agregue cinco microlitros de la mezcla de detección de anticuerpos 4X correspondiente para detectar la fosfoproteína o la proteína total. Después de cubrir la placa con un sellador de placas, incube a temperatura ambiente durante una hora o durante la noche, dependiendo del kit de ensayo.
Una vez completada la incubación, retire el sellador de placas adhesivas y lea la placa en un lector de microplacas compatible con TR-FRET. Los resultados de los ensayos TR-FRET para la detección y cuantificación de fosfo-STAT1 con STAT1 total y fosfo-STAT4 en células U266B1 junto con fosfo-STAT5 con STAT5 total en células A431 se representan utilizando curvas de respuesta de concentración. Del mismo modo, los ensayos TR-FRET para la detección y cuantificación de fosfo-STAT3 y STAT3 total y fosfo-STAT6 y STAT6 total en células HeLa se representan utilizando curvas de respuesta de concentración.
En general, todos los ensayos mostraron señales TR-FRET robustas, amplios rangos dinámicos, baja variación del coeficiente entre pozos y relaciones aceptables de señal a fondo. El tratamiento de células con activadores de JAK, interferón alfa-2B e IL-4 y EGF mostró el aumento anticipado dependiente de la concentración en la fosforilación de STAT en residuos específicos de tirosina, mientras que las proteínas STAT totales correspondientes se mantuvieron estables. Tanto el inhibidor de JAK como el erlotinib inhibieron los niveles correspondientes de fosfo-STAT de una manera dependiente de la concentración.
Los resultados de la estimulación fosfo-STAT4 por interferón alfa-2B en una línea celular de suspensión o la estimulación fosfo-STAT6 por IL-4 en una línea celular de adherencia utilizando el protocolo de una placa fueron consistentes con los obtenidos utilizando el protocolo de dos placas, mostrando así una adaptabilidad exitosa de un protocolo de transferencia de dos placas a un protocolo de pozo todo en uno de una placa. Los resultados del estudio de variabilidad intraplaca para el ensayo fosfo-STAT1 utilizando una línea celular en suspensión y el ensayo fosfo-STAT3 utilizando una línea celular de adherencia demuestran la robustez de estos ensayos fosfo-STAT para aplicaciones HTS. Es esencial complementar el tampón de lisis con el cóctel inhibidor de la fosfatasa para evitar la desfosforilación de las proteínas fosforiladas de la fosfatasa activa presente en todo el extracto celular.
