Este protocolo describe un proceso experimental paso a paso y un algoritmo matemático para cuantificar FRET utilizando la extinción del donante y la emisión sensibilizada por el aceptor. La cuantificación de las eficiencias FRET en la célula viva requiere determinar la diafonía de las proteínas fluorescentes y las eficiencias relativas de emisión y detección de los fluoróforos en la configuración microscópica. La diafonía se puede evaluar mediante imágenes de células que expresan solo un fluoróforo.
La evaluación de la eficiencia de detección de una molécula donante o aceptora requiere un conocimiento de la relación entre el número de moléculas donantes y aceptoras que dan lugar a la señal de medida. El número de fluoróforos expresados en células vivas varía de célula a célula y es desconocido. La sonda de calibración utilizada en este método, una proteína de fusión donante-aceptor uno a uno, permite determinar la eficiencia de detección relativa de las moléculas donante y aceptora.
Para comenzar, utilice un vector de expresión celular de mamíferos N1 con mCherry 1 para generar la sonda de fusión EGFP mCherry 1. Diseñar oligonucleótidos para amplificar EGFP sin un codón de parada como una célula de un fragmento BAM h1. El enlace de cinco aminoácidos entre la proteína fluorescente verde y roja debe producir una deficiencia media de FRET para el par donante-aceptor de cerezas GFP de 0.25 a 0.3.
Use cualquier línea celular y medio sin rojo fenol para reducir la fluorescencia de fondo. Una vez que las células estén 80% confluentes, separarlas con un mililitro de 0.05% tripsina EDTA y sembrar aproximadamente 10, 000 células en cada pocillo de una placa de ocho pocillos agregando tres gotas de una suspensión de células de cinco mililitros. 24 horas después del recubrimiento, transfectar las células utilizando un medio de transfección apropiado.
Incubar las células durante 20 horas antes de obtener imágenes de células vivas para permitir la expresión, el plegamiento y la maduración adecuados de las proteínas fluorescentes. Imagen de las células en una cámara ambiental humidificada y calentada a 37 grados centígrados con un microscopio de barrido confocal. Para amortiguar los medios celulares a pH fisiológico, agregue 20 HEPES milimolares para que el medio celular sea independiente del dióxido de carbono.
Luego monte el portaobjetos en el microscopio. Utilice la línea de 488 nanómetros del láser de iones de argón para excitar el GFP y el láser de diodo de 561 nanómetros para excitar la cereza. Configure el láser de 488 nanómetros para la excitación en el canal uno a través de una banda de emisión de 505 a 530 nanómetros y en el canal dos con un filtro de paso largo de más de 585 nanómetros.
Utilice el láser de 561 nanómetros para la excitación en el canal tres con un filtro de paso largo de más de 585 nanómetros. Excite los dos láseres secuencialmente y configure el modo de imagen para cambiar después de cada línea para que la excitación de la imagen de 512 por 512 píxeles se alterne después de cada línea. Configure una mini serie temporal de tres imágenes para detectar si se produce un fotoblanqueo significativo y reducir la potencia del láser si es necesario.
Primero, las células de imagen que expresan la construcción de fusión de cerezas GFP. Establezca los parámetros que definen la intensidad láser integrada en el tiempo por píxel en una imagen confocal. Utilice un objetivo de aceite de 63X y un zoom ajustado a 3X para obtener imágenes de una celda en su totalidad con suficiente aumento y resolución.
Apunte a un tamaño de píxel de 70 a 80 nanómetros. Establezca el tiempo de permanencia de píxeles de dos a cuatro microsegundos y la transmisión AOTF para el láser de 488 nanómetros y 561 nanómetros, de modo que las imágenes muestren una buena relación señal-ruido sin blanqueamiento y sin píxeles que indiquen saturación de intensidad de fluorescencia. Ajuste la potencia del láser de 488 y 561 de modo que los niveles de señal en el canal uno y el canal tres sean similares.
Establezca la ganancia del multiplicador de fotos en 600 a 800. Imagen de 15 a 20 células que expresan la proteína de fusión de cereza GFP, células que expresan GFP, cereza, GFP y cereza, y células no transeccionadas. A continuación, las células de imagen co-expresan las proteínas de interés acopladas a GFP y cereza respectivamente.
Para calcular FRET, mida la señal donante en el canal uno, el canal donante con excitación de 488 nanómetros y una banda de emisión de 505 a 530 nanómetros. Luego mida la señal aceptora en el canal tres, el canal aceptor con excitación de 561 nanómetros y emisión por encima de 585 nanómetros. Finalmente, mida la señal FRET en el canal dos, el canal de transferencia con excitación de 488 nanómetros y emisión por encima de 585 nanómetros.
La señal en el canal dos es una suma de cuatro componentes diferentes: el derrame espectral de la señal donante apagada en el canal de detección de más de 585 con un factor de diafonía S1, la señal aceptora de la excitación directa por luz de 488 nanómetros con un factor de diafonía S2, la emisión sensibilizada del aceptor por FRET de la molécula donante excitada, y la señal de fondo. Las imágenes se obtuvieron en el canal donante, el canal de transferencia y el canal aceptor, se muestran células que expresan GFP solamente, solo cereza, coexpresión de GFP y cereza, y la proteína de fusión de cereza GFP. Las eficiencias celulares medias de FRET calculadas en células NRK que expresan proteína de fusión de cereza GFP y aquellas que coexpresan cereza GFP se representan gráficamente versus la relación de intensidad de la relación aceptor-donante o la relación molecular en cada célula.
Aquí se muestran imágenes FRET normalizadas píxel por píxel de células que expresan la proteína de fusión de cereza GFP, coexpresando GFP y cereza como control negativo y expresando subunidades receptoras del receptor de Ashwell-Morell. RHL1 y 2 de la lectina hepática de rata se marcaron con GFP y cereza en el lado citoplasmático de la membrana plasmática. Las eficiencias medias celulares FRET de las células que expresan GFP RHL1 y cereza RHL2 y GFP RHL1 delta stock y cereza RHL2 se representan gráficamente frente a la relación molecular aceptor-donante.
El enfoque FRET cuantitativo presentado permite lo siguiente. Detección de interacciones proteicas en el contexto fisiológico de la célula viva. Cambios en las interacciones de proteínas a lo largo del tiempo.
Diferencias en las interacciones en compartimentos subcelulares hasta el nivel píxel por píxel de una imagen confocal. Y la dependencia de la señal FRET detectada de la relación aceptor-donante molecular expresada en una célula viva.
