Hemos desarrollado una metodología de mapeo FRET que permite la identificación y caracterización de sitios de unión de ligandos, orientación de subunidades, cambios conformacionales asociados con la unión de ligandos y movimientos dinámicos de proteínas. Una ventaja de esta técnica es que se puede realizar en solución y las moléculas pueden moverse libremente. Las distancias medidas por esta técnica son apropiadas para sistemas biológicos.
FRET es ampliamente aplicable a muchos sistemas. El mapeo mejora el monitoreo de los cambios estructurales y dinámicos en cualquier sistema biomolecular, y es particularmente efectivo si existe información estructural tridimensional. Después de purificar la proteína, la parte más difícil es etiquetar con alta eficiencia y eliminar el tinte libre.
Para los experimentos, ayuda tener la menor cantidad de tinte libre posible. Para comenzar, elija sitios de etiquetado dentro de 25 a 75 angstrom del sitio de unión punitiva, y en regiones relativamente estáticas de la proteína. La distancia determinará el par de tinte FRET específico que se utilizará.
Localice los sitios de etiquetado en regiones de proteínas que sean relativamente distintas entre sí. Así que los sitios describen los vértices de un triángulo, con el sitio de unión punitiva ubicado en el centro. Para medir los valores de R0, dependiendo del tamaño y volumen deseado de la cubeta, prepare dos muestras de proteínas a la misma concentración de proteína total.
Uno con la proteína marcada solo con el colorante donante, y otro con la proteína etiquetada solo con el tinte aceptor. Encienda el fluorómetro y abra el programa de adquisición y análisis espectral en el software FluorEssence, si utiliza un espectrofluorómetro. Haga clic en la M roja para conectar la computadora al instrumento y elija Espectros de emisión.
Introduzca los parámetros de exploración mediante el elemento del menú Recopilar experimento, como la longitud de onda de excitación, el rango de exploración de emisión, la temperatura y el cambio de posición de la muestra. Haga clic en RTC y optimice la configuración del instrumento como se describe en el manuscrito, monitoreando la emisión de fluorescencia en el pico utilizando una longitud de onda de excitación establecida en el máximo de absorción del tinte. Coloque la muestra de proteína marcada por el donante en el soporte de la muestra y haga clic en ejecutar para generar un escaneo de emisión de la proteína etiquetada solo con el colorante del donante, excitando la muestra en el máximo de absorción del tinte y escaneando sobre el pico de emisión.
Establezca una línea de base para el escaneo extendiendo el escaneo a 25 a 50 nanómetros más allá del final del pico. Medir el rendimiento cuántico de la proteína donante únicamente realizando absorciones y mediciones de fluorescencia en muestras de diferentes concentraciones, como se describe en el texto manuscrito. Prepare muestras de proteína solo donante, proteína solo aceptor y proteína donante-aceptor, a la misma concentración.
Obtener el escaneo solo del donante para generar espectros de emisión de fluorescencia. Excite la solución en el máximo de absorción del colorante del donante y escanee sobre los picos de emisión del donante y del aceptor. Cambie la muestra a la proteína solo aceptora, o cambie la muestra cambie su posición a la cubeta que contiene la proteína solo aceptora.
Obtenga un escaneo de emisión de la proteína marcada solo con el colorante aceptor. Excitar la muestra en la longitud de onda de excitación del donante. Cambie la muestra a la muestra de proteína donante-aceptor o cambie la muestra cambie su posición a la cubeta que contiene la proteína marcada donante-aceptor.
Obtenga un escaneo de emisión de la muestra de proteína donante-aceptora utilizando la misma configuración. Para todos los espectros, corrija la fluorescencia de fondo restando los recuentos de fondo medidos al final del escaneo. Utilice un programa de visualización gráfica 3D como PyMOL para mapear las distancias en la estructura, ingresando directamente los comandos del script en la ventana de comandos con la información de distancia adecuada.
Genere un shell para cada distancia medida y el error asociado. Mapee la posición a través de la intersección de las diferentes conchas. El sitio de unión al péptido de señal se mapeó utilizando tres ubicaciones diferentes en SecA y SecYEG, y cuatro ubicaciones diferentes en el péptido de señal.
Los experimentos FRET entre diferentes regiones de la preproteína y tres ubicaciones distintas en las proteínas SecA y SecYEG mapean el sitio de unión y la orientación de la preproteína. El sitio de unión punitiva del péptido de señal se identificó previamente como el dedo de dos hélices, y la cola C-terminal de SecA sugirió una orientación paralela al dedo de dos hélices. Se obtuvieron espectros FRET de estado estacionario entre SecA37, y PhoA2, y PhoA22.
La reducción en la intensidad del donante indicó que se transfirió una mayor energía desde PhoA22. En relación con el sitio PhoA2, que se encuentra más lejos de SecA37. Los espectros de desintegración por fluorescencia resueltos en el tiempo demostraron que el complejo donante-aceptor tiene una desintegración homogénea más corta consistente con la transferencia de energía asociada con una distancia.
Las conchas de distancia FRET construidas entre el residuo SecA PhoA2 y los sitios triangulados, demostraron que cada concha se cruza con el dedo de dos hélices, el sitio de unión supuesto, que se muestra en verde. El área intersectada es más pequeña que cada concha FRET e incluye una gran contribución del andamio helicoidal. Las conchas de distancia FRET determinadas entre el residuo de PhoA2 y los sitios etiquetados, describen un área más pequeña ubicada más cerca de la punta del dedo de dos hélices y la boca del canal SecYEG.
Esta área intersectada está situada en el extremo opuesto del dedo de dos hélices de PhoA2. Las cosas importantes a considerar incluyen la selección adecuada de los sitios de etiquetado para triangular el área de interés, medir los rendimientos cuánticos para cada sitio y eliminar todo el tinte libre. Este método se alinea con la información estructural obtenida con métodos como la RMN o la cristalografía de rayos X.
Cuando los resultados de FRET se colocan en un contexto estructural, puede mejorar la información existente.
