El protocolo proporciona un procedimiento simple para hacer que los experimentos FRET mediante emisiones sensibilizadas sean más reproducibles y comparables. La principal ventaja de FRET son las mediciones en tiempo real para que se puedan abordar los procesos dinámicos. Para el ajuste con láser utilizando un fotomultiplicador de transmisión, coloque la diapositiva de ocho pocillos que contiene los protoplastos transfectados bajo el microscopio.
Después de seleccionar un pozo vacío, elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma, disminuya la intensidad del láser al mínimo y ajuste la ganancia del detector al ruido de fondo detectable. A continuación, aumente la intensidad del láser en pasos del 0,5% mientras graba la señal correspondiente. Para el ajuste láser mediante el modo reflectante, seleccione un pozo vacío y, a continuación, aplique un filtro de reflexión.
Active el modo de reflexión y asegúrese de que el rango de longitud de onda del detector cubra la longitud de onda del láser. Elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma, disminuya la intensidad del láser al mínimo y ajuste la ganancia del detector al ruido de fondo detectable. A continuación, mueva el objetivo a la posición más baja antes de volver a moverlo hacia arriba hasta que el reflejo de la cubierta sea visible, luego aumente la intensidad del láser en pasos del 0,5% mientras graba la señal correspondiente.
Para la evaluación de datos, tabule y ordene los datos por intensidades de señal, luego trace las intensidades de señal contra la potencia relativa del láser y elija las intensidades del láser que resultan en una intensidad de señal similar. Para el ajuste de los fotomultiplicadores, seleccione un pozo vacío y aplique un filtro de reflexión, cambie al modo de reflexión y asegúrese de que el rango de longitud de onda del detector cubra la longitud de onda del láser. Elija el modo de escaneo de línea y la vista de histograma, disminuya la ganancia del detector a la mitad del máximo y ajuste la intensidad del láser al ruido de fondo detectable.
A continuación, mueva el objetivo a la posición más baja antes de volver a moverlo hacia arriba hasta que el reflejo del deslizamiento sea visible, luego aumente la ganancia del detector en pasos de 50 a 100 voltios y registre la señal correspondiente. Para la evaluación de datos, trace la intensidad contra la ganancia del detector para cada detector, luego elija las ganancias individuales del detector para obtener una sensibilidad similar. Para la adquisición de imágenes, elija los filtros apropiados o espejos dicroicos y use el mismo espejo dicroico para todos los canales para habilitar el escaneo línea por línea, luego seleccione un objetivo de inmersión en agua para la obtención de imágenes de células vivas y elija escaneo de 12 o 16 bits con velocidad de escaneo moderada.
A continuación, defina el rango de detección preferiblemente de 470 a 510 nanómetros para la detección de donantes y de 530 a 600 nanómetros para la detección de aceptores en el caso del par FRET de proteína fluorescente cian mejorada o ECFP y proteína fluorescente amarilla mejorada o EYFP. Después de aplicar la configuración del detector y el láser como se demostró anteriormente, revise la intensidad del láser en función de la tabla de potencia láser obtenida si es necesario. Asegúrese de que la relación señal-ruido cubra todo el rango dinámico de los detectores.
Después de ajustar el diámetro del agujero de alfiler mientras se mantienen constantes las intensidades del láser y las ganancias del detector, realice las mediciones FRET tomando imágenes de al menos 20 celdas. Para determinar las correcciones de diafonía, realice mediciones FRET con células que expresan solo el fluoróforo del donante y solo con aquellas que expresan el fluoróforo aceptor. Para la calibración de las mediciones, realice mediciones FRET con células que expresen la fusión del aceptor donante.
Para la evaluación de datos, obtenga perfiles de línea de las celdas asegurándose de que cada perfil no contenga más de una celda. Guarde los perfiles como archivos de texto. Luego, usando la opción de importación de archivos de texto en la sección de datos, importe los archivos de texto a una hoja de cálculo.
A continuación, lea los valores máximos aplicando la función máxima, luego enumere los valores obtenidos en una tabla que tenga una columna cada una para ID de emisión de donante, IF de emisión de FRET, IA de emisión de aceptor y al menos cuatro conjuntos de datos, solo donante, solo aceptor, fusión donante-aceptor y medición. El ajuste láser reveló un aumento lineal en la emisión con el aumento de la intensidad del láser. Como lo demuestra una pendiente más pronunciada, la emisión de la línea de 514 nanómetros fue mucho mayor que la emisión de la línea de 458 nanómetros.
Variar las ganancias del detector a una potencia láser constante reveló un comportamiento exponencial para ambos detectores analizados. La discrepancia y el sangrado espectral del donante y el aceptor analizados con proteínas purificadas recombinantes y analizados con células que expresan esas proteínas demuestra que es imposible omitir la determinación del sangrado espectral en células vivas probablemente causado por pigmentos celulares. La eficiencia FRET entre las subunidades ATPA vacuolares marcadas, VHA AECFP y VHA AEYFP disminuyó con el aumento de la intensidad de la señal.
Por el contrario, la interacción entre VHA E1 ECFP y VHA CEYFP fue independiente de la intensidad de la señal. La elección de los componentes ópticos adecuados es crucial para la detección del donante y el aceptor. Este protocolo también se puede aplicar para sensores ratiométricos en células vivas para aumentar la reproducibilidad en estos experimentos.
