Este protocolo permite observar y detectar eventos de transcripción y proporciona información sobre los efectos de las roturas de doble cadena de ADN en la transcripción en curso de un gen. La principal ventaja de la técnica es la observación de transcripciones de ARN marcadas individualmente en células individuales a intervalos de tiempo de segundos durante un período total de una hora o más. Este método proporciona información sobre la respuesta al daño del ADN para investigar la diafonía entre la transcripción y los procesos celulares, como la replicación del ADN y las lesiones del ADN.
Nuestro consejo es observar las células utilizando doxiciclina y realizar mediciones de calibración para entrenar la detección del sitio de transcripción y las moléculas de ARN marcadas. En un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros, prepare la solución A que contiene 150 microlitros de ADN plasmático MEM sérico reducido y 2,5 microgramos por microlitro de ADN en el reactivo auxiliar de transfección. Paralelamente, prepare la solución B que contiene 150 microlitros de MEM sérico reducido y 1,5 microgramos por microlitro de ADN en un reactivo de transfección a base de lípidos.
Incube ambas soluciones a temperatura ambiente durante cinco minutos, luego agregue suavemente la solución A a la solución B e incube durante 20 minutos a temperatura ambiente. Para transfectar las células, agregue 300 microlitros de solución mixta A y B gota a gota a cada plato y distribúyalo suavemente. Almacene el plato con fondo de vidrio dentro de un plato de cultivo celular estándar de 100 milímetros e incube a 37 grados Celsius en una atmósfera humidificada con 5% de dióxido de carbono.
Prepare un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros con 200 microlitros de DMEM con HEPES sin rojo fenol y complementado con suero bovino fetal sin carbón al 10%, luego agregue TA. Aproximadamente una hora antes de comenzar la observación con microscopía, induzca la transcripción de los genes reporteros agregando doxiciclina al medio de crecimiento y mezcle suavemente mediante pipeteo hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta de 200 microlitros. Transporte las células al microscopio al menos 30 minutos antes de comenzar la observación y coloque el plato de 100 milímetros con las células dentro de la cámara de incubación del microscopio grande precalentada. Coloque el tubo de la microcentrífuga con la TA prediluida dentro de la cámara ambiental del microscopio grande para calentarla a 37 grados centígrados.
Reemplace la tapa del plato de fondo de vidrio con una tapa que tenga un orificio perforado de tres milímetros de diámetro. Seleccione el objetivo de inmersión en aceite 100X en el panel de control del microscopio y aplique una gota de aceite de inmersión al objetivo. Coloque el plato con fondo de vidrio con las células dentro de la cámara de incubación de la etapa del microscopio y ciérrela en su lugar, luego cierre la tapa de la incubadora de la etapa y todas las puertas de la carcasa del microscopio.
Inicie el software de operación y control del microscopio, abra la ventana de control de enfoque y haga clic en el panel de alcance. En el panel de selección de emisiones, haga clic en el cuadro 100% ojo para establecer la trayectoria del haz ocular para la observación directa de la muestra a ojo. En el menú conjunto de filtros, cambie al conjunto de filtros oculares y haga clic en Campo brillante y, a continuación, pulse el botón Abrir campo brillante.
Mueva el objetivo del microscopio hacia el plato con fondo de vidrio hasta que el aceite toque el vidrio. Mire a través de los oculares y concéntrese manualmente en el plano de las células, luego apague el botón Brightfield abierto. Deje las células durante 30 minutos antes de comenzar las observaciones experimentales para permitirles adaptarse a las condiciones ambientales y evitar la deriva focal durante la toma de imágenes debido a los gradientes de temperatura.
Configure una micropipeta de 200 microlitros y puntas de filtro de 200 microlitros a temperatura ambiente. En la ventana de control de enfoque del software de control del microscopio, establezca la intensidad del láser en 5% e introduzca un valor de 50 milisegundos para el tiempo de exposición. Abra la ventana de captura para ajustar la configuración para realizar una adquisición de imagen automatizada de timelapses tridimensionales.
Seleccione el tipo de adquisición de captura 3D y establezca de 12 a 16 cortes ópticos separados por 0,4 micrómetros. Marque las casillas de verificación del rango alrededor de la corriente y vuelva a la posición actual después de la captura. En el panel de captura de lapso de tiempo, introduzca un valor de 120 para el número de puntos de tiempo y 30 segundos para el intervalo.
Seleccione el conjunto de filtros confocales de acuerdo con las etiquetas de proteínas fluorescentes transectadas como se menciona en el manuscrito de texto y establezca el tiempo de exposición para cada canal en 50 milisegundos. Utilice la corriente de ajuste de la potencia del láser para utilizar el valor de 5% seleccionado en la ventana de enfoque. En la ventana de control de enfoque, vaya al panel de la cámara, seleccione el control de visualización de imagen de escala y elija el botón manual para configurar un rango fijo de intensidades de imagen que se mostrará.
Seleccione las células para la imagen de lapso de tiempo 3D de los sitios de transcripción tras la inducción de una rotura de doble cadena de ADN. Examine las celdas y seleccione tres campos de visión de acuerdo con las condiciones descritas en la discusión del texto. Enfoque cada celda seleccionada previamente ubicada en el centro del campo de visión con el sitio de transcripción en el plano medio de la pila Z.
Marque cada posición XYZ en el plano XY de la ventana de control de enfoque haciendo clic en el punto de ajuste. Agregue 200 microlitros de la TA prediluida a las células e inicie la imagen de la serie temporal 3D haciendo clic en inicio en la ventana de captura. Guarde los datos de imagen en el formato de datos del software de control del microscopio en el disco duro de la computadora de control del microscopio.
Agregue 0.5 microgramos por mililitro de doxiciclina al medio de crecimiento de las células una hora antes de comenzar la adquisición de imágenes de microscopía. Monte el plato con fondo de vidrio dentro de la cámara de incubación de la etapa del microscopio y prepare la adquisición de la imagen como se demostró anteriormente. Utilice la misma intensidad del láser y la misma configuración de exposición que antes.
Establezca la configuración de captura para series temporales 2D y establezca 120 puntos de tiempo a intervalos de 500 milisegundos en el panel de captura de lapso de tiempo. Adquiera docenas de series de tiempo de calibración desde múltiples posiciones para generar conjuntos de datos para contar varios cientos de mediciones TFI de transcripción única. Usando este protocolo, se obtiene un gráfico que muestra el número de transcripciones de genes reporteros marcados fluorescentemente a lo largo del tiempo con una resolución temporal de segundos durante períodos de hasta horas.
El curso temporal de los valores de TFI de un sitio de transcripción del gen reportero PROM marcado por la acumulación de proteína de la capa MS2 marcada con las moléculas de proteína fluorescente verde en transcripciones nacientes se muestra aquí. La inducción de un solo DSB en los genes reporteros permite estudiar su impacto en la transcripción del gen reportero en curso y el monitoreo de los eventos de transcripción que emergen del sitio DSB, es decir, la transcripción inducida por ruptura. La adición de TA y la inducción de un DSB conduce a una supresión de la transcripción del gen reportero PROM después de aproximadamente 11 minutos que no se restaura hasta los 60 minutos.
La recuperación completa de la señal PP7-RFP muestra la iniciación de la transcripción inducida por rotura. El gen reportero antisentido EXON 2 muestra la terminación de las transcripciones impulsadas por el promotor, que luego es reemplazada por la transcripción inducida por rotura antisentido como lo revela la acumulación de proteína de la capa MS2 marcada con una proteína fluorescente roja que se une al ARN generado a partir de secuencias de bucle de tallo MS2 antisentido. Selección de las células para la obtención de imágenes, configure la imagen de lapso de tiempo tratada ajustando la posición Z del sitio de transcripción etiquetado en cada posición XY en el centro de la pila Z que se va a adquirir.
Y finalmente, la adición de la TA diluida en el medio de crecimiento debe ejecutarse con extremo cuidado para evitar cualquier cambio de las posiciones preseleccionadas con células a fotografiar. La obtención de imágenes de transcripciones de ARN individuales en 3D a lo largo del tiempo en células vivas se puede aplicar para estudiar la transcripción de ARN durante la replicación del ADN o los cambios de transcripción durante la progresión del ciclo celular.
