Apoyado en parte por R01NS064593 y R21ES016636 (KV). Microscopía se realizó en la UCV - Departamento de Servicio de Microscopía Neurobiología y Anatomía, apoyada, en parte, con fondos del NIH NINDS subvención 5P30NS047463 Center núcleo. El microscopio confocal de disco giratorio se compró con un premio NIH-CNRR (1S10RR027957).

A. Preparación de la célula <ol><li> Fibroblastos humanos normales primarios (GM02270) se obtuvieron de Coriell Cell Repository, Camden, Nueva Jersey, y se inmortalizan con hTERT 6. Las células se hicieron crecer y se expandieron en CellStar 6 cm de platos en los medios de comunicación (4 ml) que consiste en MEM suplementado con 20% fetal suero bovino (GIBCO), non-essential/essential aminoácidos, vitaminas, piruvato de sodio, y penicilina / estreptomicina (HyClone ). </li><li> De riñón embrionario humano 293 (HEK293) las células se obtuvieron a partir de American Type Culture Collection y se desarrollaron y se expandieron en CellStar 6-cm platos. Las células se mantuvieron en medios de comunicación (4 ml) que consiste en DMEM suplementado con fetales 10% de suero bovino, no aminoácidos esenciales, L-glutamina, y penicilina / estreptomicina. </li><li> 53BP1 mCherry-(N-Myc-53BP1 PESO pLPC-Puro; Addgene plásmido 19836) y H2B-GFP (pCLNR-H2BG; Addgene plásmido 17735) gen constructos de fusión también expresar puromicina o genes de resistencia a G418, respectivamente, fueron transducidas (fibroblapts) o transfectadas (HEK293) utilizando SuperFect (Qiagene) en las células y se mantiene en la selección de medicamentos. Mantenimiento de la fluorescencia se comprobó periódicamente. </li><li> 24-48 h antes de la adquisición de imágenes, las células se trataron con tripsina en una única suspensión de células y se sembraron a una densidad baja en placas de 3,5 cm de FluroDish fondo de cristal. </li></ol> B. Configuración del microscopio y de adquisición de imágenes Este protocolo fue desarrollado utilizando la Célula Zeiss Observador SD hilado disco microscopio confocal equipado con un AxioObserver Z1 stand, un dual-channel Yokagawa CSU-5000 X1A girar la unidad de disco, 2 Fotometría QuantEM 512SC cámaras EMCCD, un HXP 120C a base de fibra de iluminación, 4 láseres (un Lasos 100mW de varias líneas de argón [458, 488, 514 nm], 50 mW diodo 405 nm, 40 mW diodo 561 nm y 30 mW diodo 635 nm), AOTF, un Pecon XL etapa multiS1 sistema de incubación, incubación Zeiss módulos (Módulo de O 2 S, CO 2 Módulo S, S TempModule, Calefacción Unidad XL S) y un Prior motorized XY etapa con un inserto NanoScanZ piezo Z. Para reducir al mínimo las aberraciones esféricas, mientras que las células de formación de imágenes en vivo apoyado en un medio acuoso, un Agua C-Apochromat 63x/1.20 / Corr objetivo y lente Zeiss Immersol fluido de inmersión W (con un índice de refracción n = 1,334) fueron utilizados. Para canal 2 confocal de imágenes, un RQFT 405/488/568/647 espejo dicroico y BP525/50 (verde) y BP629/62 (rojo) se utilizaron filtros de emisión. El software del sistema utilizado fue Zeiss Axiovision (ver. 4.8.2.0) con AV4 Multi-channel/Z/T, Fast Imaging, Fisiología, Mosaix, Mark &amp; ​​Find, de doble cámara, Interior 4D, enfoque automático y 3-D módulos de deconvolución. <ol><li> Asegúrese de que el CO 2 gas se está ejecutando para el CO 2 Módulo del sistema de incubación. Si el microscopio se apoya en una mesa de aire anti-vibración, abra el suministro de aire (o gas N2) para la tabla del aire. </li><li> Encienda la alimentación del trípode del microscopio, la unidad de disco giratorio, las cámaras, los módulos de incubación, iluminación HXP, platina motorizada, Argonláser, y el ordenador. </li><li> Después de 1 minuto de tiempo de calentamiento, gire la llave de contacto para que el láser de argón a &quot;On&quot;. </li><li> En el panel de control del láser Zeiss, encienda los interruptores de las líneas de láser que se utilizarán. </li><li> Apague el interruptor de palanca para el controlador Lasos láser de argón de &quot;espera&quot; a &quot;run láser&quot; y ajustar el regulador de luz para el nivel óptimo (es decir, justo por debajo del punto en que el indicador verde se vuelve roja). </li><li> Inicie el software AxioVision Nota:. La interfaz de usuario para AxioVision pueden ser personalizados con menús de las ventanas y tirar hacia abajo que sean específicos para el microscopio especial y los componentes que lo controla. Como tal, cada sistema tiene una interfaz potencialmente única. Por lo tanto, las instrucciones generales para la manipulación de software se proporcionan en los siguientes pasos, en lugar de direcciones para las ventanas de software específicos, fichas y / o menús desplegables. </li><li> Aproximadamente 1 h antes de la formación de imágenes, en el software, localizar los controles de la incubadora yencender la calefacción de la cámara superior y la placa de la platina. Ajustar la temperatura a 37 ° C. Encienda el CO 2 Control y ajuste el nivel del 5%. </li><li> Seleccione la lente objetivo para formación de imágenes. En este estudio, un 63x/1.20 NA C-Apochromat Agua / Corr lente objetivo se utilizó Nota:. Para este objetivo, un medio de inmersión con un índice de refracción similar al del agua (Zeiss Immersol fluido de inmersión W) es necesario. </li><li> Si múltiples posiciones separadas son objeto de muestreo durante un largo período de tiempo, de aplicar una cantidad suficiente de medio de inmersión para asegurar que es transportada desde una posición a otra. </li><li> Colocar el plato de la etapa y llevar la lente del objetivo arriba en contacto con el fondo. </li><li> Usando los controles del microscopio o del software, dirigir la luz emitida a los oculares y seleccione el filtro de campo amplio establecido para la señal fluorescente de interés (para este estudio, &quot;Red&quot; filtro para 53BP1 y un &quot;buenas prácticas agrarias&quot; filtro para H2B ). &lt;/ Li&gt; <li> Ver a través de las lentes oculares, enfocar la imagen, y localizar un campo adecuado de células. </li><li> Utilizando el software o los controles del microscopio, dirigir la luz emitida fuera de los oculares al puerto con la unidad de disco giratorio confocal. </li><li> En el software, encienda el láser adecuado (para este estudio, el láser nm 561 por 53BP1 y la línea de 488 nm del láser de argón para H2B). </li><li> Para cada canal, ajustar la intensidad del láser mediante el ajuste del filtro acústico-óptico sintonizable (AOTF) de control a un nivel apropiado. </li><li> Seleccione el espejo dicroico apropiado (RQFT 405/488/568/647) y filtros de emisión (BP 629/62 para 53BP1 y BP 525/50 para H2B). Abrir el obturador a la unidad de disco giratorio. </li><li> Seleccione la opción &quot;Live&quot; ventana para mostrar el actual campo de visión. </li><li> En el software, abra el &quot;cámara&quot; de control, seleccione la cámara que desea utilizar (si es un sistema de cámara dual) y establecer el tiempo de exposición a aproximadamente 100 ms. Ajuste el% y ganar EM como necsario Nota:. La construcción 53BP1-mCherry parece un tanto débil. Nos pareció que es útil para aumentar la ganancia EM. </li><li> En el software, abra el control de la unidad de disco giratorio confocal y ajustar la velocidad de giro del disco introduciendo el tiempo de exposición de la cámara que se configuró para capturar una imagen adecuada (por ejemplo, ~ 100 ms). Haga clic en &quot;Set&quot; para guardar los cambios. </li><li> Abra &quot;multi-dimensional de adquisición&quot;. Seleccione la pestaña de canales y cargar / seleccionar los canales apropiados. Para este estudio, estamos utilizando canales definidos para dsRed (561 nm láser de excitación y BP 629/62 filtro de emisión) y las buenas prácticas agrarias (488 nm láser de línea para la excitación y BP525/50 filtro de emisión). </li><li> Para asegurar el registro de imagen, un espejo dicroico común (RQFT 405/488/568/647) se utilizó para ambos canales. Configure el software de &quot;Autofoco&quot; Nota:. Vaya a Herramientas → Configuración de editor para ajustar los valores de MDA. Asegúrese de que la potencia del láser adecuado se establece (&quot;láser de potencia adecuada&quot; se refiere a una opción que le permitepara excitar el fluoróforo apropiado mientras se minimiza foto-blanqueamiento). </li><li> En la ventana MDA, seleccione la pestaña z-stack. Seleccione &quot;Z-stack en la posición de foco actual&quot;. Ajuste el rango de ~ 10 m z-pila y elija &quot;óptimo&quot; para el número de pasos para asegurar un muestreo de Nyquist a través de Z. Nota: El tamaño exacto de la z-stack dependerá de la altura de sus células. Ajuste en consecuencia. </li><li> 23. Haga clic en &quot;Inicio&quot; y analizar el resultado z-stack en la imagen para asegurar la configuración es apropiada para lo que se está investigando (por ejemplo, en este estudio, es importante para la imagen del núcleo entero). </li><li> Seleccione la opción &quot;T&quot; (tiempo) ficha. Para nuestro experimento con camptotecina, se establece el intervalo entre los puntos de tiempo de formación de imágenes a 5 min y la duración total de la sesión de 1 hora para un control (células no tratadas) video Nota:. Para minimizar foto-blanqueamiento de las células, el experimento debe ser configurado de tal manera que el AOTF espacios en blanco el láser entre los puntos de tiempo de formación de imágenes. </li><li> Fo múltiples puntos de imagen de varias células en el plato, en la ventana MDA, seleccione la ficha posición. Asegúrese de &quot;Aplicar&quot; ajuste antes / después de punto en el tiempo &quot;posición por&quot; está marcada. Seleccione &quot;Mark_Find&quot;. Usando el &quot;Live&quot; vista, mueva el plato alrededor y seleccionar los campos apropiados de vista. </li><li> Haga clic en &quot;Inicio&quot; en el menú multi-dimensional de adquisición para iniciar el experimento y grabar un vídeo de control (de las células no tratadas). </li><li> Después de que el control de vídeo, añadir el tratamiento apropiado (en este caso, 10 camptotecina mM). Se registró el experimental (droga células tratadas) de vídeo a intervalos de 5-10 min 2-4 h Nota:. Una cuestión importante a tener en cuenta es la velocidad con que se produce un efecto determinado después del tratamiento. Como se ve en el video, 53BP1 focos comienzan a partir de ~ 5 min después de la adición de CPT. Aunque es un proceso relativamente fácil, y agregó droga para el plato manualmente y volver a calibrar el microscopio toma tiempo. Hay que prestar atención a esto cuando el diseño de experimentos. </li><li> Para el seguimiento de mitosis, fijamos el intervalo de 7,5 minutos y grabado durante 4-5 horas (la configuración específica dependerá de la línea celular utilizada y la duración de su ciclo celular). Los ajustes que tenga que hacer para evitar que la foto-blanqueamiento durante grabaciones más largas. </li></ol> C. Procesamiento de imágenes y análisis Este protocolo fue desarrollado usando software Volocity (PerkinElmer). El software utilizado para adquirir la información (AxioVision) también tiene la capacidad para procesar y analizar imágenes. Los usuarios están invitados a utilizar el software a su disposición, y consulte la bibliografía adecuada en cuanto a su aplicación. <ol><li> Abra el software Volocity. Crear y nombrar una nueva biblioteca, e importar los archivos de vídeo. </li><li> Para ver los archivos, por lo general les resulta más útil usar el &quot;Focus extendido&quot; de ajuste. Esta superpone las rebanadas z-stack y, para este protocolo, nos permite visualizar los focos 53BP1 en las diferentes áreas del núcleo. </li><li> Ajuste vídeos como sea necesario. Volocity está equipado con una gama de herramientas para mejorar la calidad de las imágenes adquiridas. Al asegurarse de que los ajustes del microscopio eran apropiadas, mucho tiempo se pueden guardar en la edición más adelante. A menudo, es útil para deconvolucionar sus imágenes y ajustar el brillo / contraste. Sus necesidades de edición específicas pueden variar basado en el experimento. </li><li> Añadir una marca de tiempo relativo y la barra de escala. </li><li> Para ver las células en 3-D, cambie a la &quot;3-D opacidad&quot; de ajuste. Esto permite la rotación de las células en 3-D prestados en el espacio, proporcionando así múltiples perspectivas de estructuras de interés dentro de las células Nota:. Es útil para visualizar las células en diferentes planos para determinar donde las estructuras de los viajes interés. Por ejemplo, en el &quot;Focus extendida&quot; ajuste es difícil discernir que el 53BP1 es, de hecho, se disocian de ADN durante la mitosis. Sin embargo, esto es fácilmente evidente en 3-D. </li><li> Las películas y las imágenes fijas pueden ser exportados a una variedad de tipos de archivos basado en la preferencia del usuario. </l<html> i&gt; </ol> D. Representante Resultados Un ejemplo de 53BP1 formación de focos en respuesta a la CPT se muestra en la figura 1. Las células expuestas a forma CPT focos dentro de 5-10 minutos, y mantener estos focos durante toda la duración de la grabación. Como se muestra en la Figura 2, 53BP1 disocia de la cromatina en el inicio de la mitosis, formando una fina neblina alrededor de los cromosomas de condensación. Como telofase se produce la mitosis y llega a su fin, 53BP1 una vez más agregados en distintos focos. Mientras que las células HEK293 no fueron expuestos a CPT, que sin embargo forman focos abundante, reparación espontánea 53BP1 generado por el daño del ADN endógeno. Esta observación nos permitió concluir que 53BP1 no formar focos durante la mitosis temprana, de acuerdo con un informe anterior que muestra un efecto similar después de la exposición de las células a la radiación ionizante y las drogas radiomiméticos 5. ure 1 &quot;src =&quot; / files/ftp_upload/4251/4251fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Camptotecina (10 mM) y provoca DSBs 53BP1 formación de focos en el ciclismo fibroblastos dentro de 30 min de la adición del fármaco al medio. <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/4251/4251fig2.jpg" /> Figura 2. 53BP1 no formar focos durante la mitosis hasta telophase/G1 en células HEK293.

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	<li>Botuyan, M. V., Lee, J., Ward, I. M., Kim, J. E., Thompson, J. R., Chen, J., Mer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+basis+for+the+methylation+state-specific+recognition+of+histone+H4-K20+by+53BP1+and+Crb2+in+DNA+repair.">Structural basis for the methylation state-specific recognition of histone H4-K20 by 53BP1 and Crb2 in DNA repair.</a> Cell. 127, 1361-1373 (2006).</li><li>Dimitrova, N., Chen, Y. C., Spector, D. L., de Lange, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1+promotes+non-homologous+end+joining+of+telomeres+by+increasing+chromatin+mobility.">53BP1 promotes non-homologous end joining of telomeres by increasing chromatin mobility.</a> Nature. 456, 524-528 (2008).</li><li>Feuerhahn, S., Egly, J. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Give+me+a+break,+but+not+in+mitosis:+the+mitotic+DNA+damage+response+marks+DNA+double-strand+breaks+with+early+signaling+events.">Give me a break, but not in mitosis: the mitotic DNA damage response marks DNA double-strand breaks with early signaling events.</a> Cell Cycle. 10, 1215-1221 (2011).</li><li>Golding, S. E., Morgan, R. N., Adams, B. R., Hawkins, A. J., Povirk, L. F., Valerie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pro-survival+AKT+and+ERK+signaling+from+EGFR+and+mutant+EGFRvIII+enhances+DNA+double-strand+break+repair+in+human+glioma+cells.">Pro-survival AKT and ERK signaling from EGFR and mutant EGFRvIII enhances DNA double-strand break repair in human glioma cells.</a> Cancer Biol. Ther. 8, 730-738 (2009).</li><li>Huyen, Y., Zgheib, O., Ditullio, R. A., Gorgoulis, V. G., Zacharatos, P., Petty, T. J., Sheston, E. A., Mellert, H. S., Stavridi, E. S., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methylated+lysine+79+of+histone+H3+targets+53BP1+to+DNA+double-strand+breaks.">Methylated lysine 79 of histone H3 targets 53BP1 to DNA double-strand breaks.</a> Nature. 432, 406-411 (2004).</li><li>Jackson, S. P., Bartek, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+DNA-damage+response+in+human+biology+and+disease.">The DNA-damage response in human biology and disease.</a> Nature. 461, 1071-1078 (2009).</li><li>Kanda, T., Sullivan, K. F., Wahl, G. 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F., Takeda, S., Taniguchi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+vertebrate+53BP1:+a+major+role+in+non-homologous+end+joining+of+DNA+double+strand+breaks.">Genetic dissection of vertebrate 53BP1: a major role in non-homologous end joining of DNA double strand breaks.</a> DNA Repair (Amst). 5, 741-749 (2006).</li><li>Schultz, L. B., Chehab, N. H., Malikzay, A., Halazonetis, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=p53+binding+protein+1+(53BP1)+is+an+early+participant+in+the+cellular+response+to+DNA+double-strand+breaks.">p53 binding protein 1 (53BP1) is an early participant in the cellular response to DNA double-strand breaks.</a> J. Cell. Biol. 151, 1381-1390 (2000).</li><li>Valerie, K., Povirk, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+and+mechanisms+of+mammalian+double-strand+break+repair.">Regulation and mechanisms of mammalian double-strand break repair.</a> Oncogene. 22, 5792-5812 (2003).</li><li>Wang, B., Matsuoka, S., Carpenter, P. B., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=53BP1,+a+mediator+of+the+DNA+damage+checkpoint.">53BP1, a mediator of the DNA damage checkpoint.</a> Science. 298, 1435-1438 (2002).</li><li>Ward, I. M., Minn, K., Jorda, K. G., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accumulation+of+checkpoint+protein+53BP1+at+DNA+breaks+involves+its+binding+to+phosphorylated+histone+H2AX.">Accumulation of checkpoint protein 53BP1 at DNA breaks involves its binding to phosphorylated histone H2AX.</a> J. Biol. Chem. 278, 19579-19582 (2003).</li></ol>

No hay conflictos de interés declarado.

Mantenimiento de la integridad genómica es crucial para la supervivencia celular. El incumplimiento de preservar los resultados del genoma en el envejecimiento prematuro, la carcinogénesis, o la muerte 8. Hay un gran interés en discernir cómo funciona el DDR, derivadas de su importancia para la investigación básica y clínica. Muchas técnicas se han desarrollado a lo largo de los años para ayudar en el estudio de cómo las células detectar y reparar el daño del ADN. Los métodos tradicionales como l...

<table border="1"><tbody><tr><td> Producto </td><td> Empresa </td></tr><tr><td> Cellstar placas de cultivo </td><td> Greiner Bio-One </td></tr><tr><td> FluroDish platos con fondo de cristal </td><td> World Precision Instruments, Inc. </td></tr><tr><td> Medio MEM </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> No esenciales de aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Los aminoácidos </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Vitaminas </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> Piruvato de sodio </td><td> Invitrogen </td></tr><tr><td> Penicilina / Estreptomicina </td><td> HyClone </td></tr><tr><td> Suero Bovino Fetal </td><td> GIBCO </td></tr><tr><td> N-Myc-53BP1 PESO pLPC-Puro; plásmido 19836 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> pCLNR-H2BG; plásmido 17735 </td><td> Addgene </td></tr><tr><td> SuperFect </td><td> Qiagen </td></tr><tr><td> Zeiss celular Observador SD Imaging System </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> AxioVision (versión 4.8.2) </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Zeiss Immersol W Petróleo </td><td> Zeiss </td></tr><tr><td> Volocity software (versión 6,0) </td><td> PerkinElmer </td></tr></tbody></table>

two- and three-dimensional live cell imaging of dna damage response proteins

Doble filamento se rompe (DSBs) son el ADN más perjudicial lesiones que una célula pueda encontrar. Si se deja sin reparar, DSBs gran puerto potencial para generar mutaciones y aberraciones cromosómicas 1. Para evitar este trauma de catalizar la inestabilidad genómica, que es crucial para las células para detectar DSBs, activan la respuesta al daño del ADN (DDR), y reparar el ADN. Cuando se estimula, el DDR trabaja para preservar la integridad genómica mediante la activación de detención del ciclo celular para permitir la reparación a tener lugar o forzar la célula a la apoptosis. Los mecanismos predominantes de reparación de DSB ocurrir a través de nonhomologous fin de unirse (NHEJ) y reparación de recombinación homóloga (HRR) (revisado en 2). Hay muchas proteínas cuyas actividades deben estar precisamente orquestada por la RDA para funcionar correctamente. En este documento, se describe un método para 2 - y 3-dimensional (D) la visualización de una de estas proteínas, 53BP1. La proteína p53 de unión 1 (53BP1) se localiza en áreas deDSBs por la unión a las histonas modificadas 3,4, formando focos dentro de 5-15 minutos 5. Las modificaciones de las histonas y el reclutamiento de proteínas DDR 53BP1 y otro a sitios de DSB se cree que facilita la reorganización estructural de la cromatina alrededor de las áreas de daño y contribuir a la reparación del ADN 6. Más allá de la participación directa en la reparación, funciones adicionales han sido descritos para 53BP1 en el DDR, tales como la regulación de un puesto de control intra-S, un punto de control G2 / M, y la activación de proteínas aguas abajo de DDR 7-9. Recientemente, se descubrió que 53BP1 no formar focos en respuesta al daño del ADN inducido durante la mitosis, en vez de espera para entrar en las células G1 antes de localizar a la vecindad de DSBs 6. Proteínas tales como DDR 53BP1 han encontrado asociación con estructuras mitóticas (tal como cinetocoros) durante la progresión a través de mitosis 10. En este protocolo se describe el uso de 2 - y 3-D imágenes de células vivas para visualizarla formación de focos 53BP1 en respuesta al agente que daña el ADN camptotecina (CPT), así como el comportamiento de 53BP1 durante la mitosis. La camptotecina es un inhibidor de topoisomerasa I que causa principalmente DSBs durante la replicación del ADN. Para lograr esto, se utilizó una anteriormente descrita 53BP1-mCherry proteína de fusión fluorescente construir consta de un dominio de proteína 53BP1 capaz de unirse DSBs 11. Además, se utilizó una histona H2B-GFP proteína de fusión fluorescente construir capaz de monitorear dinámica de la cromatina a través del ciclo celular, pero en particular durante la mitosis 12. Imágenes de células vivas en múltiples dimensiones es una excelente herramienta para profundizar en nuestra comprensión de la función de las proteínas de DDR en las células eucariotas.

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Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

De dos y tres dimensiones imágenes de células vivas de las proteínas de respuesta al daño del ADN

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

two-three-dimensional-live-cell-imaging-dna-damage-response

Research

JoVE Journal

Biology

14.0K vistas.  Virginia Commonwealth University. Este protocolo describe un método para visualizar un ADN de doble hebra proteína rotura de señalización activada en respuesta al daño del ADN, así como su localización durante la mitosis.

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Microfabrication of Chip-sized Scaffolds for Three-dimensional Cell cultivation

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell cultivation. These technologies offer a wide spectrum of advantages not only for manufacturing but also for different applications. The size and shape of formed cell clusters can be influenced by the exact and reproducible architecture of the microfabricated scaffold and, therefore, the diffusion path length of nutrients and gases can be controlled.1 This is unquestionably a useful tool to prevent apoptosis and necrosis of cells due to an insufficient nutrient and gas supply or removal of cellular metabolites.
Our polymer chip, called CellChip, has the outer dimensions of 2 x 2 cm with a central microstructured area. This area is subdivided into an array of up to 1156 microcontainers with a typical dimension of 300 m edge length for the cubic design (cp- or cf-chip) or of 300 m diameter and depth for the round design (r-chip).2
So far, hot embossing or micro injection moulding (in combination with subsequent laborious machining of the parts) was used for the fabrication of the microstructured chips. Basically, micro injection moulding is one of the only polymer based replication techniques that, up to now, is capable for mass production of polymer microstructures.3 However, both techniques have certain unwanted limitations due to the processing of a viscous polymer melt with the generation of very thin walls or integrated through holes. In case of the CellChip, thin bottom layers are necessary to perforate the polymer and provide small pores of defined size to supply cells with culture medium e.g. by microfluidic perfusion of the containers.
In order to overcome these limitations and to reduce the manufacturing costs we have developed a new microtechnical approach on the basis of a down-scaled thermoforming process. For the manufacturing of highly porous and thin walled polymer chips, we use a combination of heavy ion irradiation, microthermoforming and track etching. In this so called "SMART" process (Substrate Modification And Replication by Thermoforming) thin polymer films are irradiated with energetic heavy projectiles of several hundred MeV introducing so-called "latent tracks" Subsequently, the film in a rubber elastic state is formed into three dimensional parts without modifying or annealing the tracks. After the forming process, selective chemical etching finally converts the tracks into cylindrical pores of adjustable diameter.

We present two processes for the microfabrication of porous polymer chips for three-dimensional cell cultivation. The first one is hot embossing combined with a solvent vapour welding process. The second one uses a recently developed microthermoforming process combined with ion track technology leading to a significant simplification of manufacture.

Microfabricación de chip del tamaño de andamios para el cultivo de células en tres dimensiones

Using microfabrication technologies is a prerequisite to create scaffolds of reproducible geometry and constant quality for three-dimensional cell ...

Investigación

Biología

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

De dos fotones axotomía y de lapso de tiempo de imagen confocal en embriones de pez cebra en vivo

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

Marcaje fluorescente de COS-7 Expresando etiqueta SNAP-proteínas de fusión de imágenes de células vivas

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Two-Photon-Based Photoactivation in Live Zebrafish Embryos

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic development, cellular signaling and adult physiology. In this respect, the use of multi-photon microscopy enables quantitative photoactivation of a given light responsive agent in deep tissues at a single cell resolution. As zebrafish embryos are optically transparent, their development can be monitored in vivo. These traits make the zebrafish a perfect model organism for controlling the activity of a variety of chemical agents and proteins by focused light. Here we describe the use of two-photon microscopy to induce the activation of chemically caged fluorescein, which in turn allows us to follow cell's destiny in live zebrafish embryos. We use embryos expressing a live genetic landmark (GFP) to locate and precisely target any cells of interest. This procedure can be similarly used for precise light induced activation of proteins, hormones, small molecules and other caged compounds.

Multiphoton microscopy allows control of low energy photons with deep optical penetration and reduced phototoxicity. We describe the use of this technology for live cell labeling in zebrafish embryos. This protocol can be readily adapted for photo-induction of various light-responsive molecules.

De dos fotones basado en fotoactivación en vivo embriones de pez cebra

Photoactivation of target compounds in a living organism has proven a valuable approach to investigate various biological processes such as embryonic ...

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over developmental stages. Three-dimensional information from thin serial sections can be challenging to interpret because of the difficulty of reconstructing serial sections perfectly and maintaining proper orientation of the tissue over serial sections. Recent findings by Grosse et al., 2011 highlight the importance of three- dimensional information in understanding morphogenesis of the developing villi of the intestine1. Three-dimensional reconstruction of singly labeled intestinal cells demonstrated that the majority of the intestinal epithelial cells contact both the apical and basal surfaces. Furthermore, three-dimensional reconstruction of the actin cytoskeleton at the apical surface of the epithelium demonstrated that the intestinal lumen is continuous and that secondary lumens are an artifact of sectioning. Those two points, along with the demonstration of interkinetic nuclear migration in the intestinal epithelium, defined the developing intestinal epithelium as a pseudostratified epithelium and not stratified as previously thought1. The ability to observe the epithelium three-dimensionally was seminal to demonstrating this point and redefining epithelial morphogenesis in the fetal intestine. With the evolution of multi-photon imaging technology and three-dimensional reconstruction software, the ability to visualize intact, developing organs is rapidly improving. Two-photon excitation allows less damaging penetration deeper into tissues with high resolution. Two-photon imaging and 3D reconstruction of the whole fetal mouse intestines in Walton et al., 2012 helped to define the pattern of villus outgrowth2. Here we describe a whole organ culture system that allows ex vivo development of villi and extensions of that culture system to allow the intestines to be three-dimensionally imaged during their development.

Mouse Fetal Whole Intestine Culture System for Ex Vivo Manipulation of Signaling Pathways and Three-dimensional Live Imaging of Villus Development

Improved imaging technology is allowing three-dimensional imaging of organs during development. Here we describe a whole organ culture system that allows live imaging of the developing villi in the fetal mouse intestine.

Sistema de Cultura ratón fetal Whole Intestino para<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Manipulación de vías de señalización y tridimensional de imágenes en vivo del desarrollo de vellosidades

Most morphogenetic processes in the fetal intestine have been inferred from thin sections of fixed tissues, providing snapshots of changes over ...

FRET Imaging in Three-dimensional Hydrogels

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly employ two-dimensional (2D) culture, which does not mimic the three-dimensional (3D) cellular microenvironment. A method to perform quenched emission FRET imaging using conventional widefield epifluorescence microscopy of cells within a 3D hydrogel environment is presented. Here an analysis method for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the probe activation range is described. Measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) levels is demonstrated in chondrocytes under forskolin stimulation using a probe for EPAC1 activation (ICUE1) and the ability to detect differences in cAMP signaling dependent on hydrogel material type, herein a photocrosslinking hydrogel (PC-gel, polyethylene glycol dimethacrylate) and a thermoresponsive hydrogel (TR-gel). Compared with 2D FRET methods, this method requires little additional work. Laboratories already utilizing FRET imaging in 2D can easily adopt this method to perform cellular studies in a 3D microenvironment. It can further be applied to high throughput drug screening in engineered 3D microtissues. Additionally, it is compatible with other forms of FRET imaging, such as anisotropy measurement and fluorescence lifetime imaging (FLIM), and with advanced microscopy platforms using confocal, pulsed, or modulated illumination.

F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) imaging is a powerful tool for real-time cell biology studies. Here a method for FRET imaging cells in physiologic three-dimensional (3D) hydrogel microenvironments using conventional epifluorescence microscopy is presented. An analysis for ratiometric FRET probes that yields linear ratios over the activation range is described.

FRET Imaging en hidrogeles tridimensionales

Imaging of F&#246;rster resonance energy transfer (FRET)&#160;is a powerful tool for examining cell biology in real-time. Studies utilizing FRET commonly ...

Single-Cell Resolution Three-Dimensional Imaging of Intact Organoids

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development and function as well as disease. Fluorescence microscopy has played a major role in characterizing their cellular composition in detail and demonstrating their similarity to the tissue they originate from. In this article, we present a comprehensive protocol for high-resolution 3D imaging of whole organoids upon immunofluorescent labeling. This method is widely applicable for imaging of organoids differing in origin, size and shape. Thus far we have applied the method to airway, colon, kidney, and liver organoids derived from healthy human tissue, as well as human breast tumor organoids and mouse mammary gland organoids. We use an optical clearing agent, FUnGI, which enables the acquisition of whole 3D organoids with the opportunity for single-cell quantification of markers. This three-day protocol from organoid harvesting to image analysis is optimized for 3D imaging using confocal microscopy.

The entire 3D structure and cellular content of organoids, as well as their phenotypic resemblance to the original tissue can be captured using the single-cell resolution 3D imaging protocol described here. This protocol can be applied to a wide range of organoids varying in origin, size and shape.

Imagen tridimensional de resolución de una sola célula de organoides intactos

Organoid technology, in vitro 3D culturing of miniature tissue, has opened a new experimental window for cellular processes that govern organ development ...

Staining and High-Resolution Imaging of Three-Dimensional Organoid and Spheroid Models

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and disease modeling, drug discovery, and regenerative medicine. To fully exploit these models, it is crucial to study them at cellular and subcellular levels. However, characterizing such in vitro 3D cell culture models can be technically challenging and requires specific expertise to perform effective analyses. Here, this paper provides detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed in vitro 3D cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters. These protocols are applicable to a wide variety of organoids and spheroids that differ in their cell-of-origin, morphology, and culture conditions. From 3D structure harvesting to image analysis, these protocols can be completed within 4-5 days. Briefly, 3D structures are collected, fixed, and can then be processed either through paraffin-embedding and histological/immunohistochemical staining, or directly immunolabeled and prepared for optical clearing and 3D reconstruction (200 &#181;m depth) by confocal microscopy.

Here, we provide detailed, robust, and complementary protocols to perform staining and subcellular resolution imaging of fixed three-dimensional cell culture models ranging from 100 &#181;m to several millimeters, thus enabling the visualization of their morphology, cell-type composition, and interactions.

Tinción e imágenes de alta resolución de modelos organoides y esferoides tridimensionales

In vitro three-dimensional (3D) cell culture models, such as organoids and spheroids, are valuable tools for many applications including development and ...

Live-Cell Imaging of Transcriptional Activity at DNA Double-Strand Breaks

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far elusive how DSBs affect transcription. A reason for this was the lack of suitable tools to simultaneously monitor transcription and the induction of a genic DSB with sufficient temporal and spatial resolution. This work describes a set of new reporters that directly visualize transcription in live cells immediately after the induction of a DSB in the DNA template. Bacteriophage RNA stem-loops are employed to monitor the transcription with single-molecule sensitivity. For targetting the DSB to a specific gene region, the reporter genes are engineered to contain a single recognition sequence of the homing endonuclease I-SceI, otherwise absent from the human genome. A single copy of each reporter gene was integrated into the genome of human cell lines. This experimental system allows the detection of single RNA molecules generated by the canonical gene transcription or by DNA break-induced transcription initiation. These reporters provide an unprecedented opportunity for interpreting the reciprocal interactions between transcription and DNA damage and to disclose hitherto unappreciated aspects of DNA break-induced transcription.

This protocol presents a new reporter gene system and the experimental setup to detect transcription at DNA double-strand breaks with single-molecule sensitivity.

Imágenes de células vivas de la actividad transcripcional en roturas de doble cadena de ADN

DNA double-strand breaks (DSB) are the most severe type of DNA damage. Despite the catastrophic consequences on genome integrity, it remains so far ...

<meta charset="utf8"></head><body>Evaluación de la interacción y localización de proteínas en el daño del ADN

Proximity Ligand Assay to Localize Proteins in DNA Damage Sites

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that cooperate in this process allows the identification of alternative targets for therapeutic intervention in several diseases, such as cancer, aging-related diseases, and chronic inflammation. The Proximity Ligand Assay (PLA) emerged as a tool for estimating interaction between proteins as well as spatial proximity among organelles or cellular structures and allows the temporal localization and co-localization analysis under stress conditions, for instance. The method is simple because it is similar to conventional immunofluorescence and allows the staining of an organelle, cellular structure, or a specific marker such as mitochondria, endoplasmic reticulum, PML bodies, or DNA double-strand marker, yH2AX simultaneously. The phosphorylation of the S139 at Histone 2A variant, H2AX, then referred to as yH2AX, is widely used as a very sensitive and specific marker of DNA double-strand breaks. Each focus of yH2AX staining corresponds to one break in DNA that occurs a few minutes after the damage. The analysis of changes in yH2AX foci is the most common assay for studying if the protein of interest is implicated in DNA damage response (DDR). Whether a direct role in the DNA damage site is expected, fluorescence microscopy is used to verify the colocalization of the protein of interest with yH2AX foci. However, except for the new super-resolution fluorescence methods, to conclude, the local interaction with DNA damage sites can be a little subjective. Here, we show an assay to evaluate the localization of proteins in the DDR pathway using yH2AX as a marker of the damage site. This assay can be used to characterize the temporal localization under different insults that cause DNA damage.

<meta charset="utf8"></head><body>Autor destacado: Combinación del ensayo de ligando de proximidad con la tinción Gamma-H2AX para caracterizar las interacciones de proteínas en la respuesta al daño

Here, we present a simple and rapid protocol for the detection of protein interaction at DNA damage sites.

Ensayo de ligando de proximidad para localizar proteínas en sitios de daño en el ADN

The DNA damage response is a genetic information safeguard that protects cells from perpetuating damaged DNA. The characterization of the proteins that ...