Hasta la fecha, los organoides cerebrales diferenciados de las células madre pluripotentes es un modelo 3D vitro más cercano al tejido cerebral humano nativo. Además, los organoides cerebrales son igualmente adecuados para modelar diversas patologías del sistema nervioso central, probar sustancias farmacológicamente activas y también para su uso en medicina regenerativa. Mientras tanto, esta tecnología aún se encuentra en la etapa inicial de desarrollo.
El protocolo se puede dividir en dos grupos dependiendo del método de obtención de agregados y el cultivo posterior con diferenciación. El primero incluye protocolo y esquemas de diferenciación, diferentes en el tiempo de cultivo e inductores de diferenciación con posterior maduración de organoides en el agitador en dispositivos especiales de baja adherencia como tubos o placas de mercado. Otro grupo incluye el uso de biorreactores especiales.
El análisis de varios protocolos ha demostrado que los organoides deben cultivarse en condiciones con medio nutriente circulante. Sin embargo, la ausencia de sistemas simples y económicos para obtener organoides con un tamaño y morfología estándar requiere el desarrollo de tales dispositivos para escalar el proceso. En este trabajo, describimos nuestro método para obtener y probar mini biorreactores simples y económicos que permiten obtener grandes cantidades de organoides de alta calidad.
Cortar los tubos de centrífuga estériles de 15 mililitros en los anillos, de 7 u 8 milímetros de altura. Autoclave los anillos. Divida en migas las bajas agregaciones en placas de Petri tratadas o microbiológicas.
Disuelva aproximadamente 1 gramo de migas de plástico en 10 mililitros de cloroformo durante la noche para preparar un plástico líquido. Haga una perilla de plástico en el centro de una placa de Petri estéril de ultra baja adherencia de 6 centímetros. Hay dos formas igualmente adecuadas.
El primero, coloque el autoclave en un anillo de plástico en un centro y aplique medio mililitro de plástico líquido en el interior del anillo. El segundo, sin anillos de plástico, deja caer medio mililitro de plástico líquido en el centro de la placa de Petri. Deje los platos abiertos durante 2 o 3 horas en una campana de flujo laminar hasta que se seque por completo.
Cultivar células madre pluripotentes inducidas en el medio para células madre pluripotentes, hasta un 75 o 90% de confluencia en las placas de Petri de 35 milímetros, pre-recubiertas con una matriz disuelta en Dulbecco Modified Eagle Medium frío, y medio Fisher-12. Prepare el reemplazo de suero medio A plus. Cultivar células madre pluripotentes inducidas durante 1 día en el medio con reemplazo sérico.
Cambie el medio para las células madre pluripotentes a un medio de reemplazo sérico en el día cero de la diferenciación. Preparar medio A.Cambiar el medio a medio A en el día 2 de diferenciación. Cultivar células en medio A durante 2 semanas, medio refrescante en placas de Petri cada 2 días.
En el día 14, comience la formación de esferoides utilizando una placa de cultivo especial de 24 pozos que contiene aproximadamente 1, 200 microagres en cada pozo. Prepare una placa de cultivo de 24 pozos con microagres. Agregue a cada pozo 1 mililitro de A medio, centrífuga brevemente a 1, 300 g durante 5 minutos en un rotor de cucharón oscilante equipado con soporte de placa.
Controle bajo el microscopio que no hay burbujas en los microbuzos. Prepare el medio B.Retire el medio de la placa de Petri. Para el desprendimiento celular, trate las células con una solución de EDTA de 1,5 mililitros preparada en PBS.
Controlar el desprendimiento celular bajo el microscopio. Cosecha la célula en un tubo de 15 mililitros. Agregue 5 mililitros mezclados de Dulbecco y medio Fisher en el tubo hacia las células.
Centrifugar a 200g durante 5 minutos. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender las células en 2 mililitros de medio B.Transfiera la suspensión de células que contiene 1.000 millones de células a cada pozo de una placa de 24 pozos con micropios. Pipete suavemente las células hacia arriba y hacia abajo varias veces y centrífuga brevemente 100 g durante 1 minuto para capturar la célula en micropisos.
Controlar bajo el microscopio que las células están distribuidas uniformemente en microburos. Incubar la placa durante la noche para la agregación celular en esferoides. A la mañana siguiente, día 15, verifique bajo los microscopios la calidad de los esferoides, que son transparentes y suaves si están sanos.
Recoja cuidadosamente los esferoides de cada pozo en un tubo de 15 mililitros, deje que los esferoides se precipiten por gravedad durante 2 y 3 minutos, y luego retire el sobrenadante. Añadir a los esferoides 2 mililitros de la matriz, descongelados y ex tempore sobre hielo. Mezclar suavemente mediante pipeteo e incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos.
Para lavar el exceso de la matriz, agregue al tubo 8 mililitros de B.Pipette medio suavemente, luego centrífique el tubo durante 1 minuto a 100 g. Retire el sobrenadante. Agregue al tubo 20 mililitros de medio B, pipete suavemente, luego divida la suspensión esferoide entre mini biorreactores.
Luego coloque los mini biorreactores en una placa de Petri de 15 centímetros, que evita la evaporación del agua y la contaminación. Coloque la placa de Petri con mini biorreactores en un agitador orbital. Cultive los organoides a una velocidad de rotación de 70, 75 rpm.
El día 16, prepare el C mediano C.Transfiera el organoide en un tubo de 50 mililitros. Durante 5 minutos, déjalos caer al fondo. Aspirar el sobrenadante y añadir 5 mililitros del medio C.Volver a unir los organoides en los mini biorreactores.
Cultiva los esferoides en C medio durante 2 semanas, refrescando el medio cada 2 días. Durante estas 2 semanas, seleccione alrededor de 100 esferoides por mini biorreactores para el siguiente cultivo. El día 30, prepare el medio D.Cambie el medio de cultivo al medio D, que es un medio de maduración.
Refrescar el medio de cultivo cada 2 o 3 días durante 3 semanas. Luego use el medio D disuelto en F y GDNF. Después de 1 mes de cultivo consecutivo en medio A y B, se obtienen organoides estandarizados en tamaño y morfología.
A medida que crece, necesitan cambiar el medio con más frecuencia, hasta 4 veces a la semana también aumenta. Después de 2 meses de cultivo, alcanzan los 4 y 5 milímetros de diámetro. Y después de otro mes, 5 y 6 milímetros y el crecimiento se detiene.
La figura muestra la apariencia de la enzima organoide, secciones claras pintadas con hematoxilina y eosina. El análisis inmunohistoquímico durante 1 mes muestra la presencia de grupos SOX2 positivos de células progenitoras, incluso dentro de la parte central. En el periférico de los organoides, la proteína ácida fibrilar glial, la proteína 2 asociada a microtúbulos y la tiazina hidrolasa positiva.
Las células están concentradas, lo que corresponde a la forma madura de las neuronas. En algunos casos, se forman grupos de blancos en el área necrótica en la parte central. Esto indica la limitación de este protocolo para la obtención de organoides más grandes.
Lo más probable es que el factor limitante del crecimiento sea la tasa de difusión de nutrientes y oxígeno. Los diversos medios y tipos celulares de esferoides y probar nuestro sistema para algunos tipos de organoides. Mucho cerebro y retina, organoides combinados de células de carcinoma hepático y células madre mesenquimales, organoides combinados de llamadas madre mesenquimales de explosión capital y la diferenciación de células madre hematopoyéticas de células madre pluripotentes inducidas y organoides intestinales.
¿Fue variable en la composición inicial de las células? Factores de diferenciación, cultivo y medio, matriz extracelular, y posiblemente también la composición de la mezcla de gases, la velocidad de rotación de la plataforma y otros parámetros. Será posible obtener organoides con la misma forma, tamaño o modelo de morfología en varios órganos y tejidos.
El uso de mini biorreactores propuestos en este trabajo.
