現在までに、多能性幹細胞から分化した大脳オルガノイドは、ヒトの脳組織に最も近い3D型のvitroモデルである。さらに、大脳オルガノイドは、様々な中枢神経系の病態のモデル化、薬理学的活性物質の試験、再生医療への使用にも同様に適しています。一方、この技術は開発の初期段階にあります。
このプロトコルは、分化を伴う凝集体の取得方法とさらなる栽培に応じて2つのグループに分けることができる。最初の分化のプロトコルとスキームを含みます, 市場のチューブやプレートのような特別な低接着デバイスでシェーカーでオルガノイドのその後の成熟と栽培時間と分化誘導器で異なります.別のグループには、特殊なバイオリアクターの使用が含まれます。
様々なプロトコルの分析は、オルガノイドが循環栄養培地と条件下で栽培されるべきであることを示しています。しかし、標準サイズと形態を有するオルガノイドを得るための簡単で安価なシステムがない場合、プロセスをスケーリングするためのそのようなデバイスの開発が必要である。本研究では、高品質のオルガノイドを大量に得ることを可能にする、簡素で安価なミニバイオリアクターの入手と試験を行う方法を説明する。
無菌15ミリリットルの遠心管をリングに切り込み、高さ7~8ミリメートル。リングをオートクレーブします。処理されたまたは微生物学的なペトリ皿の低凝集をパン粉に分解する。
一晩クロロホルムの10ミリリットルに約1グラムのプラスチックパン粉を溶解し、液体プラスチックを調製します。滅菌超低接着6センチメートルペトリ皿の中央にプラスチックノブを作ります。2つの同様に適切な方法があります。
最初に、オートクレーブを中央のプラスチックリングに入れ、リングの内側に液体プラスチックの半ミリリットルを塗布します。第二に、プラスチックリングなしでペトリ皿の中央に液体プラスチックの半ミリリットルを落とします。完全な乾燥がするまで、皿流フードで2〜3時間開いたままにしておきます。
多能性幹細胞用培地中に誘導多能性幹細胞を培養し、ペトリ皿35ミリメートルで最大75または90%合流し、冷たいダルベックコ改変イーグル培地に溶解したマトリックスで前塗りし、フィッシャー-12培地を行う。培地Aプラス血清交換を準備します。血清置換を用いて培地中で1日間、誘導多能性幹細胞を培養する。
多能性幹細胞の培地を分化ゼロ日の血清置換培地に変更する。培地A.分化2日目に培地Aに変更します。培地Aで2週間培養し、2日ごとにペトリ皿に培地をさわやかにします。
14日目に、各ウェルに約1,200マイクロウェルを含む特別な24ウェル培養プレートを使用してスフェロイドの形成を開始します。マイクロウェルで24ウェルの培養プレートを準備します。各ウェルにミディアムA1ミリリットル、遠心分離機を1,300gで5分間、プレートホルダーを取り付けたスイングバケットローターに加えます。
マイクロウェルに気泡がないことを顕微鏡でコントロールする。中ミディアムB.ペトリ皿から培地を取り出します。細胞剥離の場合は、PBSで調製した1.5ミリリットルのEDTA溶液で細胞を治療します。
顕微鏡下で細胞剥離を制御します。細胞を15ミリリットルのチューブに収穫する。5ミリリットルの混合ダルベッコとフィッシャー培地をチューブに加えて細胞に向かって入れ.
200gで5分間遠心分離機。上清を取り除き、2ミリリットルの培地Bで細胞を再懸濁させ、10億個の細胞を含む細胞懸濁液をマイクロウェルを備えた24ウェルプレートの各ウェルに移す。ピペット細胞を数回上下に軽くし、遠心分離機は100gを1分間短くしてマイクロウェル内の細胞を捕捉する。
細胞がマイクロウェルに均等に分布することを顕微鏡で制御する。スフェロイド中の細胞凝集のためにプレートを一晩インキュベートします。翌朝、15日目は、健康であれば透明で滑らかなスフェロイドの品質を顕微鏡で確認してください。
慎重に15ミリリットルのチューブに各ウェルからスフェロイドを収集し、2と3分間重力によって沈殿するスプフェロイドを残し、その後、上清を除去します。マトリックスの2ミリリットルの回転楕円体に加え、解凍し、氷の上で元テンポを付ける。ピペットで軽く混ぜ、室温で30分間インキュベートします。
マトリックスの過剰を洗浄するには、穏やかにミディアムB.ピペットのチューブ8ミリリットルに追加し、100gで1分間チューブを遠心します。上清を取り除く。ミディアムBのチューブ20ミリリットルに加え、ピペットを穏やかに、ミニバイオリアクター間でスプフェロイド懸濁液を分割する。
その後、ミニバイオリアクターを15センチメートルのペトリ皿に入れ、水の蒸発と汚染を防ぎます。軌道シェーカーにミニバイオリアクターとペトリ皿を置きます。オルガノイドを回転速度70、75rpmで栽培する。
16日目に、50ミリリットルチューブに中程度のC.トランスファーオルガノイドを調製する。5分間、底に落ちるようにします。上清を吸引し、ミニバイオリアクター内のオルガノイドに再結合する培地C.の5ミリリットルを加える。
スフェロイドを培地Cで2週間栽培し、2日ごとに培地をリフレッシュする。これらの2週間の間に、次の栽培のためのミニバイオリアクターごとに約100スフェロイドを選択する。30日目に、成熟培地である培地Dに培地D.チェンジ培養培地を調製する。
栽培培地を2~3日ごとに3週間リフレッシュします。次に、FとGDNFに溶解した培地Dを使用する。1ヶ月連続して培地A及びBで培養した後、サイズ及び形態で標準化されたオルガノイドが得られる。
成長するにつれて、彼らはより頻繁に培地を変更する必要があります、週に4回までも増加します。2ヶ月の栽培後、直径4、5ミリに達する。そして、さらに1ヶ月後、5と6ミリメートルと成長が停止します。
図は、ヘマトキシリンとエオジンで塗られたオルガノイド酵素、明確な部分の外観を示しています。1ヶ月間の免疫物質化学的分析は、中枢部を含む前駆細胞のSOX2陽性クラスターの存在を示す。オルガノイドの末梢では、グリアフィブリリン酸性タンパク質、微小管関連タンパク質2、およびチアジンヒドロラーゼ陽性。
細胞は濃縮され、これは成熟した形態のニューロンに対応する。いくつかのケースでは、壊死領域上の白人のクラスターが中央部に形成されています。これは、より大きなオルガノイドを得るためのこのプロトコルの限界を示す。
最も可能性の高い, 成長の制限要因は、栄養素と酸素の拡散率です。.様々なメディアや細胞タイプのスフェロイドと、オルガノイドのいくつかの種類のシステムをテストします。脳およびレチナの多くは、肝臓癌細胞と間葉系幹細胞からのオルガノイドを組み合わせたもので、資本芽球間葉系幹細胞呼び出しからのオルガノイドと、人工多能性幹細胞および腸オルガノイドからの造血幹細胞分化を組み合わせた。
細胞の初期組成では可変でしたか?分化因子、培養、培地、細胞外マトリックス、およびおそらくガス混合物組成、プラットフォーム回転の速度、および他のパラメータも挙げている。様々な臓器や組織において同じ形状、大きさ、または形態モデルを有するオルガノイドを得ることが可能となる。
ミニバイオリアクターの使用は、この研究に提案しました。
