Ad oggi, gli organoidi cerebrali differenziati dalle cellule staminali pluripotenti sono un modello 3D in vitro più vicino al tessuto cerebrale umano nativo. Inoltre, gli organoidi cerebrali sono ugualmente adatti per modellare varie patologie del sistema nervoso centrale, testare sostanze farmacologicamente attive e anche per l'uso in medicina rigenerativa. Nel frattempo, questa tecnologia è ancora nella fase iniziale di sviluppo.
Il protocollo può essere diviso in due gruppi a seconda del metodo di ottenimento degli aggregati e dell'ulteriore coltivazione con differenziazione. Il primo comprende protocollo e schemi di differenziazione, diversi nel tempo di coltivazione e induttori di differenziazione con successiva maturazione di organoidi nello shaker in speciali dispositivi a bassa adesione come tubi o piastre di mercato. Un altro gruppo include l'uso di uno speciale bioreattore.
L'analisi di vari protocolli ha dimostrato che gli organoidi dovrebbero essere coltivati in condizioni con mezzo nutritivo circolante. Tuttavia, l'assenza di sistemi semplici ed economici per ottenere organoidi con dimensioni e morfologia standard richiedono lo sviluppo di tali dispositivi per ridimensionare il processo. In questo lavoro, descriviamo il nostro metodo per ottenere e testare mini bioreattori semplici ed economici che consentono di ottenere grandi quantità di organoidi di alta qualità.
Tagliare i tubi sterili della centrifuga da 15 millilitri negli anelli, 7 o 8 millimetri di altezza. Autoclave gli anelli. Rompere le basse aggregazioni su piastre di Petri trattate o microbiologiche in briciole.
Sciogliere circa 1 grammo di briciole di plastica in 10 millilitri di cloroformio durante la notte per preparare una plastica liquida. Fai una manopola di plastica al centro di una piastra di Petri sterile a bassissima adesione di 6 centimetri. Ci sono due modi ugualmente adatti.
Il primo, mettere l'autoclave in un anello di plastica su un centro e applicare mezzo millilitri di plastica liquida all'interno dell'anello. Il secondo, senza anelli di plastica, lascia cadere mezzo millilitro di plastica liquida al centro della capsula di Petri. Lasciare i piatti aperti per 2 o 3 ore in una cappa a flusso laminare fino alla completa secchezza.
Coltivare cellule staminali pluripotenti indotte nel mezzo per cellule staminali pluripotenti, fino al 75 o 90% di confluenza nelle piastre di Petri da 35 millimetri, pre-rivestite con una matrice disciolta in freddo Dulbecco Modified Eagle Medium e Fisher-12 medium. Preparare il mezzo A più la sostituzione del siero. Coltivare cellule staminali pluripotenti indotte per 1 giorno nel mezzo con sostituzione del siero.
Cambiare il mezzo per le cellule staminali pluripotenti in un mezzo di sostituzione del siero al giorno zero della differenziazione. Preparare il mezzo A.Cambiare il mezzo in medio A al giorno 2 di differenziazione. Coltivare le cellule nel mezzo A per 2 settimane, il mezzo rinfrescante nelle piastre di Petri ogni 2 giorni.
Al giorno 14, iniziare la formazione di sferoidi utilizzando una speciale piastra di coltura a 24 pozzetti che contiene circa 1.200 microwell in ciascun pozzetti. Preparare una piastra di coltura a 24 pozzetti con micro pozzetti. Aggiungere ad ogni pozzetto 1 millilitro di media A, centrifugare brevemente a 1.300 g per 5 minuti in un rotore a benna oscillante dotato di portapiastre.
Controlla al microscopio che non ci siano bolle nei microwell. Preparare il mezzo B.Rimuovere il mezzo dalla capsula di Petri. Per il distacco cellulare, trattare le cellule con 1,5 millilitri di soluzione EDTA preparata su PBS.
Controllare il distacco cellulare al microscopio. Raccogliere la cella in un tubo da 15 millilitro. Aggiungere 5 millilitro misti Dulbecco e Fisher medium nel tubo verso le cellule.
Centrifugare a 200g per 5 minuti. Rimuovere le cellule surnatante e ri-sospendere le cellule in 2 millilitro di mezzo B.Trasferire la sospensione di cellule contenente 1 miliardo di cellule in ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti con micro pozzetti. Pipettare delicatamente le celle su e giù più volte e centrifugare brevemente 100 g per 1 minuto per catturare la cellula in microwell.
Controllare al microscopio che le cellule siano distribuite uniformemente in microwell. Incubare la piastra durante la notte per l'aggregazione cellulare in sferoidi. La mattina dopo, giorno 15, controlla al microscopio la qualità degli sferoidi, che sono trasparenti e lisci se sani.
Raccogliere con cura gli sferoidi da ciascun pozzetto in un tubo da 15 millilitro, lasciare precipitare gli sferoidi per gravità per 2 e 3 minuti, quindi rimuovere il surnatante. Aggiungere agli sferoidi 2 millilitri della matrice, scongelati ed ex tempore su ghiaccio. Mescolare delicatamente per pipettaggio e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti.
Per lavare delicatamente l'eccesso di matrice, aggiungere al tubo 8 millilitri di B.Pipette medio, quindi centrifugare il tubo per 1 minuto a 100 g. Rimuovere il surnatante. Aggiungere al tubo 20 millilitri di medio B, pipettare delicatamente, quindi dividere la sospensione sferoide tra mini bioreattori.
Quindi posizionare i mini bioreattori in una capsula di Petri di 15 centimetri, che impedisce l'evaporazione dell'acqua e la contaminazione. Metti la capsula di Petri con mini bioreattori su uno shaker orbitale. Coltivare gli organoidi a velocità di rotazione 70, 75rpm.
Il giorno 16, preparare l'organoide C.Transfer medio in tubo da 50 millilitro. Per 5 minuti, lasciali cadere sul fondo. Aspirare il surnatante e aggiungere 5 millilitri del mezzo C.Ricongiunti agli organoidi nei mini bioreattori.
Coltivare sferoidi in C medio per 2 settimane, rinfrescando il mezzo ogni 2 giorni. Durante queste 2 settimane, selezionare circa 100 sferoidi per mini bioreattori per la successiva coltivazione. Il giorno 30, preparare il mezzo D.Cambia il mezzo di coltivazione in medio D, che è un mezzo di maturazione.
Aggiorna il terreno di coltivazione ogni 2 o 3 giorni per 3 settimane. Quindi utilizzare il mezzo D disciolto in F e GDNF. Dopo 1 mese di coltivazione consecutiva nei media A e B, si ottengono organoidi standardizzati per dimensioni e morfologia.
Man mano che cresce, hanno bisogno di cambiare il mezzo più spesso, fino a 4 volte a settimana aumenta anche. Dopo 2 mesi di coltivazione, raggiungono i 4 e 5 millimetri di diametro. E dopo un altro mese, 5 e 6 millimetri e la crescita si ferma.
La figura mostra l'aspetto dell'enzima organoide, sezioni chiare dipinte con ematossilina ed eosina. L'analisi immunoistochimica per 1 mese mostra la presenza di cluster SOX2 positivi di cellule progenitrici, anche all'interno della parte centrale. Nella periferica degli organoidi, la proteina acida fibrillare gliale, la proteina 2 associata ai microtubuli e la tiazina idrolasi positiva.
Le cellule sono concentrate, il che corrisponde alla forma matura dei neuroni. In alcuni casi, gruppi di bianchi sull'area necrotica si formano nella parte centrale. Ciò indica la limitazione di questo protocollo per ottenere organoidi più grandi.
Molto probabilmente, il fattore limitante della crescita è il tasso di diffusione di nutrienti e ossigeno. I vari media e tipi di cellule di sferoidi e testare il nostro sistema per alcuni tipi di organoidi. Un sacco di cervello e retina, organoidi combinati da cellule di carcinoma epatico e cellule staminali mesenchimali, organoidi combinati da richiami staminali mesenchimali di blast capitale e la differenziazione delle cellule staminali ematopoietiche da cellule staminali pluripotenti indotte e organoidi intestinali.
Era variabile nella composizione iniziale delle cellule? Fattori di differenziazione, coltura e mezzo, matrice extracellulare e possibilmente anche la composizione della miscela di gas, la velocità di rotazione della piattaforma e altri parametri. Sarà possibile ottenere organoidi con la stessa forma, dimensione o modello morfologico in vari organi e tessuti.
L'uso di mini bioreattori proposti in questo lavoro.
