Até o momento, os organoides cerebrais diferenciados das células-tronco pluripotentes é um modelo 3D vitro mais próximo do tecido cerebral humano nativo. Além disso, os organoides cerebrais são igualmente adequados para modelar várias patologias do sistema nervoso central, testar substâncias farmacologicamente ativas e também para uso em medicina regenerativa. Enquanto isso, essa tecnologia ainda está em fase inicial de desenvolvimento.
O protocolo pode ser dividido em dois grupos, dependendo do método de obtenção de agregados e do cultivo posterior com diferenciação. O primeiro inclui protocolo e esquemas de diferenciação, diferentes no tempo de cultivo e indutores de diferenciação com posterior maturação de organoide no shaker em dispositivos especiais de baixa adesão, como tubos de mercado ou placas. Outro grupo inclui o uso de um bioreatores especial.
A análise de vários protocolos demonstrou que os organoides devem ser cultivados em condições com meio de nutrientes circulante. No entanto, a ausência de sistemas simples e baratos para a obtenção de organoides com tamanho padrão e morfologia exigem o desenvolvimento de tais dispositivos para dimensionamento do processo. Neste trabalho, descrevemos nosso método de obtenção e teste mini bioreatores simples e baratos que possibilitam a obtenção de grandes quantidades de organoides de alta qualidade.
Corte os tubos de centrífugas estéreis de 15 mililitros nos anéis, 7 ou 8 milímetros de altura. Autoclave os anéis. Quebre baixas agregações em placas de Petri tratadas ou microbiológicas em migalhas.
Dissolva cerca de 1 gramas de migalhas plásticas em 10 mililitros de clorofórmio durante a noite para preparar um plástico líquido. Faça um botão de plástico no centro de uma placa de Petri ultra baixa adesão estéril de 6 centímetros. Há duas maneiras igualmente adequadas.
O primeiro, coloque a autoclave em um anel de plástico em um centro e aplique meio mililitro de plástico líquido no interior do anel. O segundo, sem nenhum anéis de plástico, derrube meio mililitro de plástico líquido no centro da placa de Petri. Deixe os pratos abertos por 2 ou 3 horas em um capô de fluxo laminar até a secura completa.
Cultivar células-tronco pluripotentes induzidas no meio para células-tronco pluripotentes, até 75 ou 90% de confluência nas placas de Petri de 35 milímetros, pré-revestidas com uma matriz dissolida no frio Dulbecco Modified Eagle Medium, e fisher-12 médio. Prepare o meio A mais substituição de soro. Cultivar células-tronco pluripotentes induzidas por 1 dia no meio com substituição de soro.
Mude o meio para células-tronco pluripotentes para um meio de substituição de soro no dia zero de diferenciação. Prepare o médio A.Mude o médio para médio A no dia 2 de diferenciação. Cultivar células no meio A por 2 semanas, meio refrescante em pratos petri a cada 2 dias.
No dia 14, inicie a formação de esferoide usando uma placa de cultura especial de 24 poços que contém aproximadamente 1.200 microwells em cada poço. Prepare uma placa de cultura de 24 poços com microwells. Adicione a cada poço 1 mililitro de médio A, centrífuga brevemente a 1,300g por 5 minutos em um rotor de balde balançando equipado com suporte de placa.
Controle sob o microscópio que não há bolhas em microwells. Prepare o B médio.Retire o meio da placa de Petri. Para o descolamento celular, trate as células com solução EDTA de 1,5 mililitros preparadas em PBS.
Controle o desprendimento celular sob o microscópio. Colme a célula em tubo de 15 mililitros. Adicione 5 mililitros misturados Dulbecco e fisher médio no tubo em direção às células.
Centrífuga a 200g por 5 minutos. Remova as células supernasceres e suspendam-se em 2 mililitros de B médio.Transfira a suspensão das células contendo 1 bilhão de células em cada poço de uma placa de 24 poços com microwells. Células de pipeta suavemente até e para baixo várias vezes e centrífuga brevemente 100g por 1 minuto para capturar células em microwells.
Controle sob o microscópio que a célula é distribuída uniformemente em microwells. Incubar a placa durante a noite para agregação celular em esferoides. Na manhã seguinte, dia 15, verifique sob os microscópios a qualidade dos esferoides, que são transparentes e suaves se saudáveis.
Colete cuidadosamente os esferoides de cada poço em um tubo de 15 mililitros, deixe os esferoides precipitarem pela gravidade por 2 e 3 minutos, e depois remova o sobrenatante. Adicione aos eferóides 2 mililitros da matriz, descongelado e ex tempore no gelo. Misture suavemente por pipetar e incubar em temperatura ambiente por 30 minutos.
Para lavar o excesso da matriz, adicione ao tubo 8 mililitros de B.Pipette média suavemente, em seguida, centrifugar o tubo por 1 minuto a 100g. Remova o supernatante. Adicione ao tubo 20 mililitros de B médio, pipeta suavemente, em seguida, divida a suspensão esferoide entre mini bioreatores.
Em seguida, coloque os mini bioreatores em uma placa de Petri de 15 centímetros, o que impede a evaporação da água e a contaminação. Coloque a placa de Petri com mini bioreatores em um agitador orbital. Cultive os organoides a velocidade de rotação 70, 75rpm.
No dia 16, prepare organoide médio de transferência para tubo de 50 mililitros. Por 5 minutos, deixe-os cair no fundo. Aspire o supernatante e adicione 5 mililitros do médio C.Junte os organoides nos mini bioreatores.
Cultivar esferoides em C médio por 2 semanas, refrescando o meio a cada 2 dias. Durante essas 2 semanas, selecione cerca de 100 esferoides por mini bioreators para o seguinte cultivo. No dia 30, prepare o médio D.Mude o cultivo de médio para médio D, que é um meio de maturação.
Refrescar o meio de cultivo a cada 2 ou 3 dias durante 3 semanas. Em seguida, use o D médio dissolvido em F e GDNF. Após 1 mês de cultivo consecutivo nos médios A e B, são obtidos organoides padronizados em tamanho e morfologia.
À medida que cresce, eles precisam mudar o meio com mais frequência, até 4 vezes por semana também aumenta. Após 2 meses de cultivo, atingem 4 e 5 milímetros de diâmetro. E depois de mais um mês, 5 e 6 milímetros e o crescimento pára.
A figura mostra o aparecimento de enzima organoide, seções claras pintadas com hematoxilina e eosina. A análise imunohistoquímica por 1 mês mostra a presença de grupos positivos SOX2 de células progenitoras, inclusive dentro da parte central. No periférico dos organoides, proteína ácida fibrilar gliana, proteína associada a microtúbulos 2 e hidrolase de tiazina positiva.
As células estão concentradas, o que corresponde à forma madura de neurônios. Em alguns casos, grupos de brancos na área necrosada são formados na parte central. Isso indica a limitação deste protocolo para a obtenção de organoides maiores.
Provavelmente, o fator limitante do crescimento é a taxa de difusão de nutrientes e oxigênio. Os vários tipos de esferoides de mídia e células e testando nosso sistema para alguns tipos de organoides. Muitos cérebros e retinas, organoides combinados de células carcinoma hepáticas e células-tronco mesenquimais, organoides combinados de chamadas de tronco mesenquimal de explosão capital e a diferenciação de células-tronco hematopoiéticas de células-tronco pluripotentes induzidas e organoides intestinais.
Foi variável na composição inicial das células? Fatores de diferenciação, cultura e matriz média, extracelular, e possivelmente também a composição da mistura de gás, a taxa de rotação da plataforma e outros parâmetros. Será possível obter organoide com a mesma forma, tamanho ou modelo de morfologia em vários órgãos e tecidos.
O uso de mini bioreatores propostos neste trabalho.
