La importancia de nuestro método radica en su capacidad para responder a la pregunta, ¿cuáles son las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares, las fibras que suspenden la lente dentro del ojo? La principal ventaja de nuestra técnica es que puede cuantificar las propiedades viscoelásticas de las pequeñas y delicadas fibras zonulares de ratones con y sin modificaciones genéticas específicas. Las mutaciones en los genes que codifican las proteínas de las microfibrillas subyacen a varias afecciones sindrómicas hereditarias.
Usando nuestra técnica, podemos investigar cómo mutaciones específicas alteran las propiedades biomecánicas de las microfibrillas. Para comenzar, después de la eutanasia del ratón, retire los ojos con fórceps finos. Inserta la punta de una aguja de fijación a través de la pared del ojo y colócala en el centro del humor vítreo, teniendo cuidado de no dañar el cristalino.
Transfiera cuidadosamente el ojo empalado a un tubo lleno de solución salina tamponada con paraformaldehído al 4% y fosfato. Abra la válvula que conecta la aguja a un depósito fijado ubicado a 25 centímetros por encima de la muestra que mantiene una presión positiva equivalente a 15 a 20 milímetros de mercurio dentro del ojo durante el período de fijación y deje que la muestra se fije durante la noche. Al día siguiente, retire la aguja de fijación y lávese el ojo durante 10 minutos en solución salina tamponada con fosfato.
Mediante el empleo de tijeras quirúrgicas oftálmicas y un microscopio estereoscópico, haga una incisión de espesor completo en la pared del ojo cerca de la cabeza del nervio óptico. Extienda el corte hacia adelante hacia el ecuador y luego alrededor de la circunferencia ecuatorial del ojo mientras evita cuidadosamente los delicados procesos ciliares y las fibras zonulares asociadas. Exponga la superficie posterior de la lente retirando la parte posterior del globo.
Retire el ojo disecado de la solución tampón con fórceps y colóquelo en una toallita seca con la córnea hacia abajo. Arrastre suavemente la córnea sobre la superficie de la toallita para secarla. Aplique una gota de pegamento instantáneo en la parte inferior de una placa de Petri de 50 milímetros y fije la plataforma a ella.
Coloque el plato en la placa del escenario del microscopio estereoscópico para que el pozo con el pegamento esté a la vista. Para acomodar el ojo en los pozos de la plataforma de la placa de Petri, agregue tres microlitros de pegamento instantáneo. Colóquelo con cuidado en el pozo y ajuste rápidamente para que la parte posterior de la lente mire hacia arriba.
Seque el lado expuesto de la lente secando suavemente con la esquina de una toallita seca. Para medir la respuesta viscoelástica zonular, encienda la báscula, coloque la placa de Petri en la báscula y, a continuación, inicie el programa de registro de incrustaciones y el software de la cámara. Encienda el controlador del servomotor.
Inicie la aplicación del controlador en la computadora y configure los parámetros de movimiento con incrementos de 50 micrómetros. Crea una curvatura de 90 grados en una varilla capilar. Deslice el capilar doblado en el soporte de la sonda capilar y apriete los tornillos de sujeción.
A la punta capilar, agregue una pequeña cuenta de pegamento de curado UV. Mueva la punta de la sonda capilar utilizando los ajustes manuales en el manipulador y colóquela directamente sobre la parte superior de la lente. A través de la inspección visual frontal y la vista lateral utilizando una cámara de microscopio, examine que la parte inferior del pegamento UV aparece centrada sobre la parte superior de la lente.
Mientras mira a través de la cámara, baje la punta de la sonda hasta que el pegamento UV haga contacto con la lente y cubra de 1/3 a 1/2 de su superficie superior. Cure el pegamento utilizando una fuente de luz UV direccional casi visible de 380 a 400 nanómetros de longitud de onda y una intensidad de aproximadamente un milivatio. Agregue la solución de PBS a la placa de Petri hasta que el ojo esté cubierto a una profundidad de al menos dos milímetros.
Coloque una lente cilíndrica frente al microscopio y de manera cercana a la placa de Petri sin tocarla. Al mismo tiempo, inicie el registro en un programa de temporizador. Tome una foto del ojo y la sonda con la cámara.
Después de 60 segundos, comience un desplazamiento de 50 micrómetros. Repita cada 60 segundos hasta que se complete el experimento, como lo indica la ruptura de todas las fibras zonulares. Guarde los datos de registro de escala al finalizar una ejecución y expórtelos a un formato de hoja de cálculo compatible.
Además, guarde las imágenes de la lente obtenidas durante la carrera. Importe los datos a una hoja de cálculo. Usando la primera y la última lectura de escala, interpole la deriva en la lectura de fondo a lo largo del tiempo debido a la evaporación, luego reste el fondo interpolado de la lectura en cada punto de tiempo.
Después de realizar el ensayo y corregir la evaporación, se invierte el gráfico de los datos viscoelásticos. La magnitud de las fuerzas instantáneas y relajadas aumenta con cada paso hasta aproximadamente 1, 000 segundos, luego disminuye a medida que las fibras zonulares comienzan a romperse hasta que se alcanza el punto de tiempo de 1, 500 segundos cuando se rompen todas las fibras. Para esta demostración, también se comparó la respuesta viscoelástica para ratones de tipo salvaje y deficientes en MAGP-1.
En el tiempo inicial de cero a 600 segundos, los gráficos se parecen entre sí, lo que sugiere que las propiedades viscoelásticas de las fibras zonulares no se alteraron significativamente. Sin embargo, en el ratón knockout MAGP-1, las fibras se rompen prematuramente. Las fuerzas de rotura de la fibra zonular se obtuvieron con el método pull-up para MAGP-1 versus ratones de tipo salvaje en etapas de un mes y un año de edad.
Los resultados indicaron que la fuerza de las fibras aumenta con la edad para los ratones de tipo salvaje. Cualquier contacto accidental con la placa de Petri durante estos pasos puede hacer que la pared del ojo se desplace en relación con la lente del ojo, dañando potencialmente las fibras zonulares. Este ensayo pull-up ayuda a identificar las proteínas que contribuyen a la resistencia a la tracción de las microfibrillas.
Usaremos esta información para construir modelos más realistas del interior de las fibras zonulares.
